ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Kwa sehemu ya kemikali ya Sekta ya Kemikali, Upungufu wa SPECC1L husababisha kuongezeka kwa uthabiti wa viungo vilivyounganishwa na kupunguza umwagaji wa seli za neural ya fuvu.

Asante kwa kutembelea Nature.com.Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Kwa Sekta ya Kemikali

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ni mtengenezaji anayeongoza ambaye amebobea katika mabomba ya chuma cha pua isiyo na mshono, mirija ing'aayo iliyofungwa, mirija iliyofumwa isiyo na mshono n.k.Ili kuwezesha wateja, tuna svetsade mabomba na zilizopo pia.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ina vifaa vya juu zaidi vya kuzalisha na kupima.Tunaweza kukidhi mahitaji yako kabisa.Kulingana na kiwango madhubuti sana, mirija ambayo hutolewa na sisi daima ina OD sahihi na uvumilivu wa WT.Udhibiti wa uvumilivu ni madhubuti kulingana na viwango vya uzalishaji.bidhaa zetu ni daima kuridhika na wateja.Wateja walinunua bidhaa zetu walitengeneza faida zaidi.
a) OD ( Kipenyo cha Nje ): 3.18mm hadi 101.6mm
b) WT ( Unene wa Ukuta): 0.5mm hadi 20mm
c) Urefu: Kulingana na mahitaji ya mteja
d) Viwango : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 na kadhalika
e) Mbinu ya Mchakato : ERW, EFW n.k

Vitelezi vinavyoonyesha makala tatu kwa kila slaidi.Tumia vitufe vya nyuma na vinavyofuata ili kusogeza kwenye slaidi, au vitufe vya kidhibiti cha slaidi mwishoni ili kusogea kwenye kila slaidi.
Seli za neural crest cell (CNCC) huteleza kutoka kwa mikunjo ya neural ya kiinitete na kuhamia matao ya koromeo, ambayo huunda sehemu kubwa ya miundo ya uso wa kati.Ukosefu wa utendaji wa CNCC una jukumu muhimu katika etiolojia ya ufa wa orofacial, ulemavu wa kawaida wa kuzaliwa.Mabadiliko ya Heterozygous SPECC1L yamepatikana kwa wagonjwa walio na mipasuko ya atypical na syndromic.Hapa, tunaripoti uwekaji madoa ulioimarishwa wa vijenzi vya makutano ya kiambatisho ya kisheria (AJ), β-catenin na E-cadherin katika seli zilizoboreshwa za SPECC1L, na maikrografu za elektroni zinaonyesha mgawanyiko wa apical-basal wa AJ.Ili kuelewa dhima ya SPECC1L katika mofogenesis ya fuvu, tumeunda muundo wa kipanya wenye upungufu wa Specc1l.Vigeuzi vya homozigosi ni hatari kwa kiinitete na huonyesha kufungwa kwa mirija ya neva na kunyonya kwa CNCC.Uchafu wa protini ya AJ huongezeka katika mikunjo ya neva inayobadilika.Kasoro hii ya AJ inalingana na kasoro katika upunguzaji wa CNCC, inayohitaji kufutwa kwa AJ.Kwa kuongeza, mutants za Specc11 zimepunguza ishara za PI3K-AKT na apoptosis iliyoongezeka.In vitro, uzuiaji mdogo wa kuashiria PI3K-AKT katika seli za aina-mwitu ulitosha kushawishi mabadiliko ya AJ.Muhimu zaidi, mabadiliko ya AJ yaliyotokana na kuporomoka kwa SPECC1L yanaweza kutenduliwa kwa kuwezesha njia ya PI3K-AKT.Ikijumlishwa, data hizi zinapendekeza kuwa SPECC1L, kama kidhibiti riwaya cha uashiriaji wa PI3K-AKT na baiolojia ya AJ, inahitajika kwa ajili ya kufungwa kwa mirija ya neva na kuweka utabaka kwa CNCC.
Seli za neural crest cells (CNCCs) hujiweka ndani ya neuroectoderm ya uti wa mgongo na kujitenga na neuroepithelium ya mikunjo ya neva inayoendelea kupitia mchakato unaohusisha mpito wa epithelial-mesenchymal (EMT)1,2,3.CNCC za epithelial zinazohama huvuruga makutano ya seli na kuwa CNCC za mesenchymal zinazojaza matao ya koromeo ya kwanza na ya pili na kuunda sehemu kubwa ya gegedu ya fuvu.Kwa hivyo, jeni zinazodhibiti utendakazi wa CNCC mara nyingi hukatizwa katika etiolojia ya hitilafu za kuzaliwa za fuvu la fuvu kama vile mipasuko ya orofacial, mara nyingi huathiri watoto 1/800 waliozaliwa nchini Marekani pekee.Moja ya kasoro za kuzaliwa8.
Delamination ya CNCC sanjari na kufungwa kwa anterior neural tube kati ya 8.5 na 9.5 siku ya maendeleo ya kiinitete katika panya.Mabadiliko ya idadi ya jeni zinazohusiana na mpasuko wa panya pia huonyesha aina fulani ya kasoro ya mirija ya neva, ikijumuisha Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, na Pdgfrα12.Hata hivyo, michakato ya kufungwa kwa mirija ya neva na uwekaji utabakaji wa CNCC inaweza kuchukuliwa kuwa huru, kwani panya mutant ya Splotch (Pax3) huonyesha kasoro katika kufungwa kwa mirija ya neva bila athari yoyote kwenye utabakaji wa CNCC au uhamiaji 13,14.Miundo ya ziada ya panya iliyo na kasoro katika utenganishaji wa CNCC na kufungwa kwa mirija ya neva itasaidia kubainisha msingi wa kawaida wa molekuli wa michakato hii miwili.
Kutengwa kwa CNCC kutoka kwa seli za neuroepithelial kunahitaji kufutwa kwa makutano ya wambiso (AJs), ambayo yanajumuisha tata za protini zenye, kati ya zingine, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, na α-actinin inayohusishwa na nyuzi za actin 2. Uchunguzi wa kujieleza kupita kiasi E-cadherin katika mikunjo ya neural ilionyesha kupunguzwa au kuchelewa kwa CNCC delamination.Kinyume chake, ukandamizaji wa E-cadherin husababisha utabaka wa mapema15,16.Sababu nyingi zinazopatanisha EMT wakati wa uwekaji utabaka wa CNCC ni sababu za unukuzi (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) na protini za urekebishaji za matrix ya nje ya seli (ECM) kama vile matrix metalloproteinases (MMPs), hata hivyo CNCCs ni vidhibiti vya moja kwa moja vya cytoskeletal AJ. bado haijajulikana.Njia ya PI3K-AKT inajulikana kupinga viwango vya E-cadherin, haswa kutokana na utafiti wa saratani17.Uchunguzi wa hivi majuzi umeonyesha kuwa upotezaji wa uwekaji saini wa PI3K-AKT kulingana na PDGFα kwenye panya husababisha kasoro za uso wa fuvu, ikijumuisha kaakaa iliyopasuka na kasoro za mirija ya neva12.Hata hivyo, uhusiano kati ya njia ya PI3K-AKT na uthabiti wa AJ kwenye utabakaji wa CNCC hauko wazi.
Hapo awali tulitambua SPECC1L kama jeni ya kwanza inayobadilika katika watu wawili walio na mwanya mkubwa unaoanzia mdomoni hadi kwenye jicho, unaojulikana kama mwanya wa oblique (ObFC) au mwanya wa Tessier IV18.Mabadiliko ya SPECC1L yametambuliwa katika familia mbili za vizazi vingi zilizo na ugonjwa wa Opitz G/BBB (OMIM #145410), ambapo watu walioathiriwa walionyesha umbali wa juu na kupasuka kwa mdomo/palate19, na katika familia moja iliyo na ugonjwa wa Tibi overdistance ( OMIM #145420)20 .zaidi ya nusu ya visa vya ugonjwa wa Opitz G/BBB vimeunganishwa kwa X (OMIM #300000) na husababishwa na mabadiliko katika jeni ya MID1, ambayo husimba protini 22 ya mifupa ya seli inayohusishwa na mikrotubu.Tunakisia kwamba SPECC1L, pia protini inayohusishwa na mikrotubuli na actin cytoskeleton, inaweza kupatanisha uashiriaji unaohitajika kwa ajili ya urekebishaji wa sitoskeletoni ya actin wakati wa kushikamana kwa seli na uhamaji 18 .Kupitia masomo ya vitro na vivo, sasa tunaelezea SPECC1L kama kidhibiti riwaya cha uthabiti wa AJ kupitia uwekaji saini wa PI3K-AKT.Katika kiwango cha seli, upungufu wa SPECC1L ulisababisha kupungua kwa kiwango cha protini ya pan-AKT na ongezeko la utawanyiko wa apical-basal wa AJ, ambao uliondolewa na uanzishaji wa kemikali wa njia ya AKT.Katika hali halisi, viinitete vyenye upungufu wa Specc11 huonyesha kufungwa kwa mirija ya neva na kupunguza mgawanyiko wa CNCC.Kwa hivyo, SPECC1L hufanya kazi katika uwekaji ishara wa msingi wa ushikamano wa seli unaohitajika kwa utendakazi wa kawaida wa CNCC wakati wa mofojenesisi ya uso.
Ili kuangazia jukumu la SPECC1L katika kiwango cha seli, tulitumia laini ya seli ya osteosarcoma iliyoelezewa hapo awali yenye upungufu katika SPECC1L18.Seli hizi thabiti za U2OS zilizo na SPECC1L (kd) zilipungua kwa wastani (60-70%) katika viwango vya nakala na protini za SPECC1L, pamoja na kasoro za uhamaji na upangaji upya wa actin cytoskeleton 18. Kinyume chake, upungufu mkubwa wa muda mfupi katika SPECC1L imeonyeshwa kusababisha kasoro za mitotiki 23 .Baada ya kubainisha sifa zaidi, tuligundua kwamba seli zetu thabiti za SPECC1L-kd zilibadilisha mofolojia kwa kiwango cha juu sana cha muunganiko (Mchoro 1).Seli za udhibiti wa mtu binafsi na seli za kd kwenye muunganiko wa chini zilionekana sawa (Mchoro 1A, D).Saa 24 baada ya kuunganishwa, seli za udhibiti zilihifadhi umbo lao la mchemraba (Mchoro 1B, E), huku seli za SPECC1L-kd zikirefushwa (Mchoro 1C, F).Kiwango cha mabadiliko haya katika umbo la seli kilinaswa na taswira ya moja kwa moja ya seli za udhibiti na seli za kd (filamu 1).Ili kubainisha dhima ya SPECC1L katika seli zinazoungana, tulichunguza kwanza usemi wake.Tuligundua kuwa viwango vya protini vya SPECC1L viliongezeka baada ya kuunganishwa (Mchoro 1G), ilhali viwango vya manukuu vya SPECC1L havikuongezeka (Mchoro 1H).Kwa kuongezea, msongamano wa seli ulipoongezeka, protini ya SPECC1L ilijilimbikiza kwenye mipaka ya seli (Mchoro 2A-E), ikiwa na muundo unaoingiliana na ule wa β-catenin inayohusishwa na utando (Mchoro 2A'-E').Kwa kuzingatia uhusiano wa SPECC1L na actin cytoskeleton 18,23 tulidhania kuwa SPECC1L huingiliana na makutano ya wambiso yenye msingi wa actin (AJ).
(AF) Seli za SPECC1L kuangusha (DF) hurefuka katika muunganisho wa juu (F) ikilinganishwa na udhibiti wa seli za U2OS (AC).Inayoonyeshwa hapa ni alama tatu kati ya saa sita (T1, T3, T6) ambazo tulichagua kwa msongamano tofauti wa seli.(G) Uchanganuzi wa doa wa Magharibi unaoonyesha kuwa protini ya SPECC1L imetulia kwa kiwango cha juu cha muunganiko ikilinganishwa na kiwango cha chini cha muunganiko katika seli za udhibiti.Mzunguko wa Magharibi wa SPECC1L unaonyesha bendi ya kDa 120 inayotarajiwa na mkanda wa juu zaidi wa uzito wa molekuli, ikiwezekana kubadilishwa baada ya kutafsiri (*).Uchambuzi wa doa wa Magharibi ulifanywa chini ya hali sawa kwa muunganisho wa chini na wa juu.Picha zinazoonyesha SPECC1L kwa muunganiko wa chini na wa juu zilichukuliwa kutoka doa moja.Kibabu hicho kilitolewa na kuchunguzwa upya kwa kutumia kingamwili ya β-actin.(H) Uchambuzi wa kiasi wa RT-PCR haukuonyesha mabadiliko makubwa katika viwango vya manukuu vya SPECC1L.Pau za hitilafu zinawakilisha SEM kutoka kwa majaribio manne huru.
(AE) Tulichagua alama sita za muda (T1-T6) zinazowakilisha msongamano wa seli ili kuhalalisha uchanganuzi wa umbo la seli na mabadiliko ya AJ katika visanduku vya U2OS kwa kubomoa SPECC1L (kd).Hatua tano za kwanza kati ya hizi zilijumuisha seli moja (T1), muunganisho wa 50-70% wa vikundi vidogo vya seli (T2), muunganisho bila kutengeneza upya seli za kd (T3), kuunda upya seli za kd (T4), na mabadiliko ya saa 24.katika mfumo wa nyuma wa seli za kd (T5).Protini ya SPECC1L ilitawanywa kwa kiasi kikubwa katika saitoplazimu katika T1 (A), lakini mkusanyiko wake ulionekana kwenye mipaka ya seli katika pointi za wakati zilizofuata (B-E, mishale).(FJ) β-catenin inaonyesha mkusanyiko sawa katika mipaka ya intercellular inayohusishwa na tata ya AJ.(A'-E') SPECC1L na β-catenin huonyesha madoa yanayopishana kwenye mipaka ya seli kwenye msongamano mkubwa wa seli (mishale).(F'-J') Katika seli za SPECC1L-kd, uwekaji madoa wa β-catenin huonekana kawaida katika msongamano wa seli ya chini (F'-H'), lakini hupanuka kadiri umbo la seli unavyobadilika (I', J'; mishale), ikionyesha kuwa AJ yamebadilika.Baa = 10 µm.
Kisha tulijaribu kubaini athari za upungufu wa SPECC1L kwenye AJ.Tulitumia alama nyingi zinazohusiana na AJ, ikiwa ni pamoja na vipengele vya kisheria F-actin, myosin IIb, β-catenin, na E-cadherin24,25,26,27.Nyuzi za mkazo za Actin ziliongezeka katika seli za SPECC1L-kd kama ilivyoelezwa hapo awali (Mchoro 3A, B) 18 .Myosin IIb inayohusishwa na filamenti za actin ilionyesha ongezeko sawa la seli za SPECC1L-kd katika vitro (Mchoro 3C, D).β-catenin inayohusishwa na AJ hufungamana na kadherini kwenye utando wa seli, ikionyesha muundo wa kawaida wa usemi wa "asali" katika udhibiti wa cubocytes (Mchoro 3E, G).Jambo la kushangaza, katika picha bapa kwa kutumia hadubini confocal, β-catenin (Mtini. 3E, F) na E-cadherin (Mtini. 3G, H) Madoa juu ya utando wa seli ya confluent SPECC1L-upungufu seli ilionyesha mwelekeo maarufu wa madoa kupanuliwa.Upanuzi huu wa uwekaji madoa wa β-catenin unaohusishwa na AJ katika seli za kd ulionekana zaidi wakati wa muunganiko, lakini ulionekana kutangulia mabadiliko katika umbo la seli (Mchoro 2F-J, F'-J').Ili kubaini hali halisi ya uwekaji madoa huu wa AJ uliopanuliwa, tulichunguza mipaka ya seli kwenye uso wa apical-basal wa seli za SPECC1L-kd U2OS kwa njia ya darubini ya elektroni (TEM) (Mchoro 3I,J).Tofauti na seli za udhibiti (Mchoro 3I), ambao ulikuwa na kanda zenye mnene wa elektroni zinazoonyesha AJ (mishale), seli za kd (Kielelezo 3J) zilionyesha mikoa mikubwa, iliyopakana ya msongamano mkubwa wa elektroni inayoonyesha AJ kando ya ndege ya apicobasal..Kwa kuongezea, kwenye sehemu zinazopita, tuliona mikunjo ya utando wa seli nyingi katika seli za kd (Mchoro S1A, B), ambayo inaelezea muundo uliopanuliwa wa bendi za β-catenin na E-cadherin (Mchoro 3F, H).Katika kuunga mkono jukumu la SPECC1L katika AJs, β-catenin ilikuwa co-immunoprecipitated na SPECC1L katika lysates ya seli confluent U2OS (Mtini. 3K).Pamoja na kuongeza kinga ya mwili kwa vialamisho vya AJ, uchanganuzi wa TEM ulilingana na dhana yetu kwamba upungufu wa SPECC1L huongeza wiani wa AJ apical-basal na tofauti.
(AH) Kuongezeka kwa rangi ya F-actin katika seli za kd saa 48 baada ya kuunganishwa (T6; A, B).Madoa yaliyobadilishwa ya myosin IIb yanayohusiana na F-actin (C, D).Muundo laini wa β-catenin na E-cadherin utando unaotia doa katika seli za udhibiti (E, G) uliimarishwa katika seli za SPECC1L-kd (F, H).Baa = 10 µm.(I–J) Maikrografu za elektroni zinazotazama makutano ya apical-basal intercellular.Seli za udhibiti huonyesha maeneo mahususi yenye minene ya elektroni yanayoonyesha makutano ya kunata (I, mishale).Kwa kulinganisha, makutano yote ya apical-basal katika seli za SPECC1L-kd zilionekana zenye elektroni (J, mishale), ikionyesha kuongezeka kwa msongamano na mtawanyiko wa makutano ya wambiso.(K) β-catenin iliingizwa kwa kinga mwilini na SPECC1L katika lisati za seli za U2OS zilizoungana.Picha iliyochukuliwa kutoka sehemu moja inayowakilisha mojawapo ya majaribio manne huru.
Ili kuelewa jukumu la SPECC1L katika mofogenesis ya craniofacial, tuliunda muundo wa kipanya wenye upungufu wa Specc1l kwa kutumia mistari miwili huru ya ES trap cell, DTM096 na RRH048 (BayGenomics, CA), ambayo inawakilisha intron 1 na Specc1l nakala zilinaswa saa 15 (Mtini. 1) .4A, takwimu S2).Eneo la genomic la kuingiza vekta ya decoy lilitambuliwa na mpangilio mzima wa jenomu na kuthibitishwa na PCR (Mchoro S2).Miundo yote miwili ya mitego ya jeni pia iliruhusu muunganisho wa fremu wa waandishi wa Specc11-lacZ baada ya kunaswa.Kwa hivyo, usemi wa lacZ ulioamuliwa na uwekaji madoa wa X-gal ulitumiwa kama kiashirio cha usemi wa Specc11.Aleli zote mbili zilionyesha ruwaza sawa za usemi wa lacZ, huku mtego wa jeni wa DTM096 katika intron 1 ukionyesha usemi wenye nguvu zaidi kuliko RRH048 katika intron 15 (haijaonyeshwa).Hata hivyo, Specc1l inaonyeshwa sana, ikiwa na mwonekano mkali hasa katika mikunjo ya neva katika E8.5 (Mchoro 4B), katika mirija ya neva na michakato ya usoni katika E9.5 na E10.5 (Mchoro 4C, D), na katika kukuza viungo. kwa E10.5 na macho (Kielelezo 4D).Hapo awali tuliripoti kwamba usemi wa SPECC1L katika upinde wa koromeo wa kwanza katika E10.5 ulikuwepo kwenye epithelium na mesenchyme18 ya msingi, kulingana na ukoo wa CNCC.Ili kujaribu usemi wa SPECC1L katika CNCC, tulifanya mikunjo ya neva ya E8.5 (Mchoro 4E-J) na sehemu za fuvu za E9.5 (Mchoro 4K-).Katika E8.5, SPECC1L iliweka mikunjo ya neva kwa nguvu (Mchoro 4E, H), ikijumuisha seli zilizotiwa alama za NCC (Mchoro 4G, J).Katika E9.5, SPECC1L (Kielelezo 4K, N) chenye madoa vikali CNCC inayohama iliyochanganywa na AP2A (Mchoro 4L, M) au SOX10 (Mchoro 4O, P).
(A) Uwakilishi wa kiratibu wa jeni ya Specc11 ya kipanya inayoonyesha uwekaji wa vekta ya decoy katika ES DTM096 (intron 1) na RRH048 (intron 15) kloni za seli.(BD) uwekaji wa lacZ wa viinitete vya heterozygous Specc1lDTM096 vinavyowakilisha usemi wa Specc1l kutoka E8.5 hadi E10.5.NE = neuroectoderm, NF = mkunjo wa neva, PA1 = upinde wa koromeo wa kwanza.(EP) Kinga ya SPECC1L yenye vialama vya NCC AP2A na SOX10 katika mikunjo ya neva ya E8.5 (NF; EJ) na sehemu za fuvu za E9.5 (KP).Uchafuzi wa SPECC1L ulizingatiwa sana katika mikunjo ya neva E8.5 (E, H; vichwa vya mshale), ikijumuisha seli zilizo na alama za AP2A (F, G; vichwa vya mshale) na SOX10 (I, J; vichwa vya mishale).Katika E9.5, SPECC1L yenye madoa makali ya CNCC zinazohama (K, N; mishale) yenye lebo AP2A (L, M; mishale) na SOX10 (O, P; mishale).
Kuvuka kati ya panya heterozygous Specc1lDTM096/+ na Specc1lRRH048/+ panya huonyesha kwamba aleli mbili za mtego wa jeni hazikamilishani na kwamba heterozigoti changamano na homozigoti za kiinitete kwa aleli ya jeni ya mtego wa jeni ni hatari ya kiinitete (Jedwali S1).Uwiano wa Mendelian ulionyesha kupungua kwa kiwango cha maisha cha heterozygotes wakati wa kuzaliwa (inatarajiwa 1.34 dhidi ya 2.0).Tulibainisha vifo vya chini vya perinatal kati ya heterozygotes, baadhi walikuwa na anomalies ya craniofacial (Mchoro S3).Hata hivyo, kupenya kwa chini kwa phenotypes hizi za perinatal craniofacial hufanya iwe vigumu kuchunguza mifumo yao ya msingi ya patholojia.Kwa hivyo, tuliangazia phenotype hatari ya kiinitete ya homozygous Specc11 mutants.
Mchanganyiko mwingi wa heterozygous au homozygous Specc1lDTM096/RRH048 viinitete vilivyobadilika havikutokea baada ya E9.5-10.5 (Mchoro 5A-D), na mrija wa neva haukufunga kwa nje (Mtini. 5B, D) na wakati mwingine kufungwa nyuma (haujaonyeshwa) ..Kasoro hii ya kufungwa kwa mirija ya neva ya fuvu ilihusishwa na idadi kubwa ya CNCC iliyowekwa alama DLX2 iliyosalia katika mikunjo ya neva katika E10.5, ikionyesha kutopasuliwa (Mchoro 5A'-D').Ili kubaini kama ukubwa wa jumla wa CNCC pia ulipunguzwa, tuliweka alama kwenye mistari ya CNCC na GFP katika mitego yetu ya jeni kwa Wnt1-Cre na ROSAmTmG.Tunatiririsha GFP+ NCC na GFP- (RFP+) isiyo ya NCC kutoka kwa viinitete nzima.Katika E9.5, uwiano wa CNCC zilizopangwa kwa mtiririko wa GFP hazikubadilika sana kati ya WT na viinitete vinavyobadilika (havijaonyeshwa), ikionyesha vipimo vya kawaida vya CNCC.Kwa hivyo, tulidhania kuwa mabaki ya Wnt1-Cre na DLX2 ya kuweka madoa katika mikunjo ya neva (Mchoro 5B') yalitokana na uwekaji kasoro wa CNCC, pengine kutokana na kuongezeka kwa msongamano au mtawanyiko wa seli za AJ, kama inavyoonekana katika seli za SPECC1L-kd.Tulitumia alama za NCC SOX10, AP2A, na DLX2 ili kuthibitisha kuwepo kwa CNCC katika mkunjo wa neva (Mchoro 5E-R).Katika E8.5, uchafu wa neural kwa alama zote tatu za NCC ulizingatiwa katika sehemu za WT (Mchoro 5E, G, I) na Specc1l mutant (Mchoro 5F, H, J).Katika E9.5, wakati alama za NCC zilichafua NCC inayohama katika sehemu za WT (Mchoro 5M, O, Q), madoa ya mabaki ya NCC yalionekana katika mikunjo ya neva ya Specc1l ya viinitete vinavyobadilikabadilika (Mchoro 5N, P, R).Kwa sababu SOX10 na DLX2 alama za CNCC zinazohama, tokeo hili linapendekeza kwamba CNCC ambazo hazina SPECC1L hufikia vipimo vya baada ya kuhama lakini zimeshindwa kuhama kutoka kwenye mikunjo ya neva.
Upungufu wa Specc11 husababisha kufungwa kwa mirija ya neva yenye kasoro, kupunguka kwa chembechembe za neural ya fuvu na AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Kiinitete kilichobeba seli zinazohama za neural neural crest cells (CNCC) zilizo na lebo ya Wnt1-Cre (A').Kinyume chake, viinitete vinavyobadilikabadilika vya Specc11 vinaonyesha mikunjo ya neva iliyo wazi (B), vichwa vya vishale) na CNCC ambazo hazijahama (B', vichwa vya vishale).(C, D') Picha za uga zinazong'aa (C, D') na kinga (C', D') za kialama cha CNCC DLX2 cha E10.5 WT viinitete (C, C') na Specc1l (D, D').Katika viinitete vya WT E10.5, CNCC chanya DLX2 hutawala matao ya gill (C', mishale), wakati katika mabadiliko, uchafu unaoonekana huendelea kwenye mikunjo ya neva iliyo wazi (D', mishale) na katika matao ya koromeo ya kwanza (D', mishale).) yenye rangi fulani (mishale) inayoonyesha upungufu na uhamaji wa CNCC.ER) Sehemu za WT na Specc1l viinitete vinavyobadilika katika hatua za E8.5 (E–L) na E9.5 (M–R) ziliwekewa alama za NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) na DLX2 (I, J, Q, R).Katika E8.5, uwekaji madoa wa NCC ulionekana katika mkunjo wa neva wa aina ya mwitu (NF) na sehemu zinazobadilikabadilika.Co-madoa ya SOX10 na β-catenin katika E8.5 WT (K) na mutant (L) ilifunua kuongezeka kwa β-catenin kwenye mipaka ya seli katika mikunjo ya neva.Katika E9.5, uchafuzi wa aina ya mwitu wa CNCC zinazohama (M, O, Q) ulionekana, wakati katika mutants, CNCC ambazo hazijadhibitiwa ziliweka mikunjo ya neural wazi (N, P, R).(S–Z) Uchanganuzi wa uwekaji lebo katika vivo AJ katika sehemu za coronal za WT na Specc11DTM096/RRH048 viinitete vilivyo na mabadiliko ya E9.5.Takriban ndege ya sehemu inaonyeshwa kwenye kona ya juu kulia.Katika sehemu za tishu za mutant, kuongezeka kwa uchafu wa F-actin (S, T) na myosin IIb (U, V) ilizingatiwa.Sawa na matokeo ya in vitro katika Mtini. 3, katika viinitete vinavyobadilikabadilika, uwekaji madoa wa utando ulioimarishwa wa β-catenin (W, X) na E-cadherin (Y, Z) ulionekana.(AA-BB) Maikrografu ya elektroni ya sehemu ya kiinitete cha aina ya mwitu kinachotazama nje ya mpaka wa seli ya apical-basal inaonyesha eneo mahususi lenye msongamano wa elektroni linaloonyesha makutano ya wambiso (AA, mishale).Kinyume chake, katika sehemu za Specc11 viinitete vinavyobadilikabadilika (BB, mishale), makutano yote ya apicobasal ni mnene wa elektroni, ikionyesha msongamano ulioongezeka na mtawanyiko wa makutano ya wambiso.
Ili kupima dhana yetu kwamba kupunguzwa kwa tabaka kunatokana na AJ iliyobadilishwa, tulichunguza uandishi wa AJ katika mikunjo ya neva ya Specc1l ya viinitete vinavyobadilikabadilika (Mchoro 5S-Z).Tuliona ongezeko la nyuzi za mkazo wa actin (Mchoro 5S, T) na kuongezeka kwa ujanibishaji wa myosin IIB kwenye nyuzi za actin (Mchoro 5U, V).Muhimu zaidi, tuliona kuongezeka kwa uchafu wa β-catenin (Mchoro 5W, X) na E-cadherin (Mchoro 5Y, Z) kwenye mipaka ya intercellular.Pia tulichunguza uchafuzi wa β-catenin wa NCC katika mikunjo ya neva ya viinitete vya E8.5 (Mchoro 5K, L).Uchafuzi wa β-catenin ulionekana kuwa na nguvu zaidi katika mikunjo ya neva inayobadilika ya Specc1l (Kielelezo 5L na K), ikipendekeza kuwa mabadiliko ya AJ yalikuwa yameanza.Katika maikrografu ya elektroni ya sehemu za fuvu la viinitete E9.5, tuliona tena ongezeko la uwekaji madoa wa elektroni-mnene katika viinitete Specc1l vinavyobadilika ikilinganishwa na WT (Mchoro 5AA, BB na S1E-H).Yakijumlishwa, matokeo haya yanaauni matokeo yetu ya in vitro katika seli za SPECC1L-kd U2OS na kupendekeza kuwa uwekaji madoa wa AJ uliopotoka utangulie utabaka wa CNCC katika viinitete vyetu vinavyobadilikabadilika.
Kwa kuzingatia uhusiano wa kipinzani unaojulikana kati ya shughuli za AKT na uthabiti wa E-cadherin,17,28 tulidhania kuhusika kwa utoaji wa ishara wa PI3K-AKT.Kwa kuongezea, tuliona malengelenge ya sehemu ya chini ya ngozi katika baadhi ya viinitete vyetu vilivyobadilika ambavyo viliepuka hatari (<5%) katika E9.5-10.5 na badala yake vilikaa karibu na E13.5 (Mchoro S3).Vipuli vya ngozi ya usoni ni alama mahususi ya kupungua kwa uashiriaji wa PI3K-AKT kulingana na PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) iliripoti kuwa kukatizwa kwa uanzishaji wa PI3K yenye msingi wa PDGFRα katika PdgfraPI3K/PI3K viini vinavyobadilika husababisha mishipa ya ngozi, kasoro za mirija ya neva na phenotypes za kaakaa iliyopasuka.Hakika, viwango vya pan-AKT na Ser473-AKT ya fosforasi hai vilipunguzwa kwa nguvu katika tishu za mutant za Specc1l hadi E9.5 kukamatwa kwa kiinitete (Mchoro 6A-D).Kupungua kwa viwango vya Phosphorylated Ser473-AKT kunaweza kuwa kabisa kutokana na kupungua kwa viwango vya pan-AKT katika vivo (FIG. 6E) na in vitro (FIG. 6F).Kupungua kwa vitro kulizingatiwa tu wakati seli za U2OS ziliunganishwa sana na mabadiliko katika umbo la seli na msongamano wa AJ (Mchoro 6D).Kwa hivyo, data zetu zinaonyesha kuwa SPECC1L ni kidhibiti cha riwaya cha PI3K-AKT kinachoashiria katika morphogenesis ya craniofacial.
(A–E) E8.5 (A,B) na E9.5 (C,D) sehemu za fuvu au lisaiti E9.5 kutoka kwa viinitete vinavyobadilikabadilika vya Specc1l (E) vinavyoonyesha viwango vya S473-AKT amilifu ya fosforasi na upunguzaji wa protini ya pan-AKT. , ikilinganishwa na udhibiti wa WT.Uzuiaji wa Magharibi ulifanywa kwa lysates za aina ya mwitu na lisaiti za mutant chini ya hali sawa.Picha zilizoonyeshwa kwa SPECC1L zilichukuliwa kutoka kwa doa moja.Waa lile lile liliondolewa na kuchunguzwa tena kwa kingamwili za anti-pan-ACT na β-actin.Viwango vya Pan-AKT katika mikunjo ya neva ya E8.5 (A, B) na viwango vya S473-AKT ya fosforasi katika sehemu za fuvu za E9.5 vilipunguzwa kwa kiasi kikubwa.(F) Viwango vya Pan-AKT vilipunguzwa vile vile katika seli za SPECC1L-kd U2OS zilizovunwa kwa msongamano wa juu.Pau za hitilafu zinawakilisha SEM kutoka kwa ukadiriaji tatu huru za Magharibi.(GJ) Sehemu za viinitete vya WT katika E9.5 vilivyotiwa rangi ya KI67 na caspase 3 iliyopasuliwa, mtawalia, kuonyesha kuenea kwa seli (G, G') na shughuli ndogo ya apoptotic (H, H').Viinitete vya Specc11 vinavyobadilikabadilika huonyesha kuenea kwa seli (I), lakini idadi ya seli zinazopitia apoptosis imeongezeka kwa kiasi kikubwa (J).
Kisha tulichunguza alama za kuenea na apoptosis.Hatukuona tofauti yoyote katika ueneaji wa viinitete vya E9.5 (Mchoro 6E, G ikilinganishwa na I) na fahirisi ya kuenea kwa 82.5% kwa mutants wa WT na 86.5% kwa mutants za Specc1l zilizopimwa kwa uwekaji wa KI67 (p <0.56, Fisher's mtihani halisi).Vile vile, hatukuona tofauti yoyote katika apoptosisi iliyopimwa kwa kuweka madoa kwa caspase 3 iliyopasuka katika mikunjo ya neva katika E8.5 hadi kukamatwa kwa kiinitete (haijaonyeshwa) (haijaonyeshwa).Kwa kulinganisha, apoptosis iliongezeka kwa kiasi kikubwa katika viinitete vyote vya mutant E9.5 (Mchoro 6F, H na J).Ongezeko hili la jumla la apoptosis linalingana na kupungua kwa ishara za PI3K-AKT na kifo cha mapema cha kiinitete29,30,31.
Kisha, ili kuthibitisha jukumu la sababu la kuashiria PI3K-AKT katika mabadiliko ya AJ katika seli zetu za kd, tulibadilisha kemikali njia ya udhibiti na seli za kd (Mchoro 7A-F).Tulitumia kama kialamisho mabadiliko ya umbo la kisanduku cha phenotype inayozingatiwa katika visanduku vya kuunganishwa vya SPECC1L-kd, ambavyo tulikadiria kwa kutumia uwiano wa kipimo kirefu zaidi (urefu) na kipimo cha wima kinacholingana (upana).Uwiano wa 1 unatarajiwa kwa seli zenye duara kiasi au mchemraba (Mchoro 7G).Mbali na umbo la seli, tulithibitisha pia athari kwa AJ kwa uwekaji madoa wa β-catenin (Mchoro 7A'-F').Uzuiaji wa njia ya PI3K-AKT kwa kutumia wortmannin ulitosha kubadilisha umbo la seli katika seli za udhibiti (Mchoro 7A, C) na AJ (Mchoro 7A').Kiwezesha PI3K-AKT SC-79 hakikuathiri umbo la seli (FIG. 7A, E) au upanuzi wa AJ (FIG. 7A') katika visanduku vya udhibiti.Katika seli za SPECC1L-kd, ukandamizaji zaidi wa njia ya PI3K-AKT ulisababisha apoptosis kuongezeka (Mchoro 7B, D) na ongezeko kubwa la uwekaji wa β-catenin (Mchoro 7B'), sambamba na mabadiliko yetu mazito ya vivo.Muhimu zaidi, uanzishaji wa njia ya PI3K-AKT uliboresha kwa kiasi kikubwa umbo la seli (Mchoro 7B, F) na phenotypes za AJ (Mchoro 7B").Mabadiliko katika umbo la seli yalibainishwa kuwa uwiano wa mzunguko wa seli (CCR) na ikilinganishwa kwa umuhimu kama ilivyoelezwa hapo juu (FIG. 7G).Hakika, katika seli za udhibiti (Mchoro 7G, CCR = 1.56), matibabu ya wortmannin yalikuwa ya kutosha kubadilisha kwa kiasi kikubwa sura ya seli (Mchoro 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) kwa kiasi sawa na ile iliyozingatiwa. katika SPECC1L.seli -kd (Mchoro 7G, CCR = 3.46).Matibabu ya Wortmannin ya seli za SPECC1L-kd (Kielelezo 7G, CCR = 3.60, isiyo na maana) haikuwa muhimu zaidi kuliko seli za kd zisizotibiwa (Kielelezo 7G, CCR = 3.46, isiyo na maana) au seli za udhibiti wa kutibiwa na wortmannin (Mchoro 7G)., CCR = 3.46, isiyo na maana) pia huathiri urefu wa seli (7G, CCR = 3.61, isiyo na maana).Muhimu zaidi, activator SC-79 AKT ilirejesha phenotype ndefu ya seli za SPECC1L-kd (Mchoro 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Matokeo haya yanathibitisha kwamba SPECC1L inadhibiti ishara ya PI3K-AKT na kupendekeza kuwa kupungua kwa wastani kwa SPECC1L huathiri kushikamana kwa seli, wakati kupungua kwa nguvu husababisha apoptosis (Mchoro 8).
(A–F') Udhibiti (A, C, E) na seli SPECC1L-kd (B, D, F) zilizotibiwa kwa PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) au SC-79 activator (E, F) .Seli za udhibiti ambazo hazijatibiwa ni cuboidal (A) zenye rangi ya kawaida ya β-paka kwenye seli (A'), ilhali seli za kd zimerefushwa (B) na kuongezeka kwa madoa ya β-paka (B').Baada ya ukandamizaji wa njia ya PI3K-AKT, seli za udhibiti zilirefushwa (C) na upanuzi wa β-paka (C'), huku seli za kd zilianza kupitia apoptosis (D), sawa na viinitete vyetu vilivyobadilishwa sana na kuonyesha β-paka iliyoimarishwa sana.kuchorea (D').Baada ya uanzishaji wa njia ya PI3K-AKT, seli za udhibiti zilisalia kuwa cuboidal (E) na zilikuwa na rangi ya kawaida ya β-paka (E'), huku seli za kd zilionyesha umbo la seli (F) na β-paka (F') lililoboreshwa sana, ikionyesha. (G) Kiwango cha mabadiliko ya umbo la kisanduku katika (AF) kilihesabiwa kwa kutumia uwiano wa mzunguko wa seli (CCR) wa mwelekeo mrefu zaidi (urefu) na mwelekeo wa wima unaolingana (upana) kwa kutumia programu ya MetaMorph.Seli ambazo hazijatibiwa (NT) SPECC1L-kd (CCR = 3.46) zilikuwa ndefu zaidi kuliko seli za udhibiti (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13).Uzuiaji wa Wort wa njia ya PI3K-AKT katika seli za udhibiti ulitosha kusababisha urefu sawa katika umbo la seli (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Vile vile, kuwezesha AKT na SC-79 katika seli za SPECC1L-kd zilirejesha urefu wa seli hadi viwango vya udhibiti (CCR = 1.74, p <6.2 × 10–12).Matibabu ya Wortmannin ya seli za SPECC1L-kd yalisababisha apoptosis kuongezeka lakini hakuna ongezeko zaidi la mabadiliko ya umbo la seli (CCR=3.60) ikilinganishwa na kd isiyotibiwa (CCR=3.46, ns) au seli za udhibiti zilizotibiwa na wortmannin (3.61) zilizozingatiwa katika .ns = haijalishi.+/- Vipimo vya SEM kwa seli 50 vinaonyeshwa.Tofauti za takwimu zilikokotolewa kwa kutumia jaribio la t la Mwanafunzi.
(A) Uwakilishi wa kimkakati wa kuzuia na kuwezesha njia ya PI3K-AKT kusababisha mabadiliko na uokoaji wa AJ, mtawalia.(B) Muundo unaopendekezwa wa uimarishaji wa protini ya AKT na SPECC1L.
CNCC za uhamiaji huhitaji uchanganuzi wa AJ kutenganisha na seli za neva za neva za anterior1,15,32.Kuongezeka kwa uchafu wa vipengele vya AJ na kupoteza usambazaji wa apical-basal AJ asymmetric katika seli zenye upungufu wa SPECC1L katika vitro na katika vivo, pamoja na ukaribu wa kimwili wa SPECC1L hadi β-catenin, zinaonyesha kuwa SPECC1L hufanya kazi ili kudumisha uthabiti wa ndani wa AJ kwa misuli ya shirika.actin cytoskeleton.Uhusiano wa SPECC1L na actin cytoskeleton na β-catenin na ongezeko la idadi ya filamenti za actin zilizofupishwa bila SPECC1L inalingana na ongezeko lililoonekana la wiani wa AJ.Uwezekano mwingine ni kwamba kuongezeka kwa idadi ya nyuzi za actin katika seli zenye upungufu wa SPECC1L husababisha mabadiliko katika mvutano wa seli.Kwa sababu mkazo wa seli huathiri mienendo ya AJ 33, mabadiliko ya voltage yanaweza kusababisha kuenea zaidi kwa AJ 34.Kwa hivyo mabadiliko yoyote yataathiri tabaka za CNCC.
Wnt1 inaonyeshwa katika mikunjo ya mapema ya neva ambayo hutoa seli za neural crest.Kwa hivyo, ufuatiliaji wa mstari wa Wnt1-cre huweka alama za NCC35 za awali na zinazohama.Hata hivyo, Wnt1 pia huweka alama za clones za tishu za ubongo wa mgongo pia zinazotokana na mikunjo ya awali ya neural 35,36, hivyo basi kuna uwezekano kwamba uwekaji madoa wetu wa mabadiliko ya E9.5 kwa vialamisho vya Wnt1 katika mikunjo ya neva iliyo wazi si CNCC.Madoa yetu chanya kwa alama za NCC AP2A na SOX10 zilithibitisha kuwa mikunjo ya neva iliyofichuliwa ya viinitete vinavyobadilikabadilika vya Specc11 hakika ilikuwa na CNCC.Zaidi ya hayo, kwa kuwa AP2A na SOX10 ni viashirio vya NCC inayohama mapema, madoa chanya yalionyesha kuwa seli hizi ni CNCC zinazohama ambazo haziwezi kupangwa kwa E9.5.
Data yetu inapendekeza kwamba udhibiti wa molekuli ya AJ na SPECC1L unapatanishwa na uwekaji saini wa PI3K-AKT.Uwekaji ishara wa AKT umepunguzwa katika seli na tishu zenye upungufu wa SPECC1L.Matokeo ya Fantauzzo et al.kusaidia jukumu la moja kwa moja la kuashiria PI3K-AKT katika morphogenesis ya fuvu.(2014) ilionyesha kuwa ukosefu wa kuwezesha uwekaji saini wa PI3K-AKT unaotokana na PDGFRα husababisha mgawanyiko wa kaakaa.Pia tunaonyesha kuwa uzuiaji wa njia ya PI3K-AKT unatosha kubadilisha AJ na umbo la seli katika seli za U2OS.Kulingana na matokeo yetu, Kaini et al.37 ilionyesha kuwa upunguzaji wa udhibiti wa kitengo kidogo cha PI3K α110 katika seli za mwisho husababisha ongezeko sawa la rangi ya β-catenin ya pericellular, inayojulikana kama ongezeko la "index ya muunganisho".Hata hivyo, katika seli za endothelial ambazo filamenti za actin tayari zimepangwa sana, ukandamizaji wa njia ya PI3K-AKT husababisha umbo la seli huru.Kinyume chake, seli za SPECC1L-kd U2OS zilionyesha umbo la seli iliyorefushwa.Tofauti hii inaweza kuwa maalum ya aina ya seli.Ingawa ukandamizaji wa ishara za PI3K-AKT huathiri kabisa sitoskeletoni ya actin, athari kwenye umbo la seli hubainishwa na mabadiliko ya mvutano unaosababishwa na mabadiliko ya msongamano na mpangilio wa nyuzi za actini.Katika seli za U2OS, tulitumia mabadiliko ya umbo la seli pekee kama kialamisho cha mabadiliko na urejeshaji wa AJ yenye upungufu wa SPECC1L.Kwa kumalizia, tunakisia kwamba kuzuiwa kwa njia ya AKT katika upungufu wa SPECC1L huongeza uthabiti wa AJ na kupunguza upunguzaji wa data kwenye CNCC.
Inashangaza, viwango vya pan-AKT vilipunguzwa katika vitro na katika vivo pamoja na viwango vya phosphorylated 473-AKT kwa kutokuwepo kwa SPECC1L, na kupendekeza udhibiti wa ishara za PI3K-AKT katika kiwango cha utulivu wa protini ya AKT au mauzo.Jeni za SPECC1L na MID1, zote zinazohusishwa na ugonjwa wa Opitz/GBBB, husimba protini zinazoimarisha mikrotubulari 18,22.Utaratibu ambao SPECC1L na MID1 hupatanisha uimarishaji wa mikrotubuli haueleweki kikamilifu.Kwa upande wa SPECC1L, uimarishaji huu unajumuisha uimarishaji wa acetylation wa kikundi kidogo cha microtubules 18.Inawezekana kwamba SPECC1L hutumia mbinu sawa ili kuleta uthabiti wa protini nyingine kama vile AKT.Imeonyeshwa kuwa acetylation ya mabaki ya lysine katika protini ya AKT husababisha kupungua kwa ujanibishaji wa membrane na phosphorylation38.Kwa kuongeza, ubiquitination ya mnyororo wa K63 kwenye mabaki ya lysine sawa kwenye AKT inahitajika kwa ujanibishaji wa membrane na uanzishaji39,40.Miongoni mwa sababu kadhaa zinazoingiliana na protini za SPECC1L zilizotambuliwa katika skrini mbalimbali za juu za chachu ya mseto mbili, nne - CCDC841, ECM2942, APC na UBE2I43 - zimehusishwa katika mauzo ya protini au utulivu kupitia ubiquitination au sumoylation.SPECC1L inaweza kuhusika katika urekebishaji wa baada ya kutafsiri wa mabaki ya lysine ya AKT, na kuathiri uthabiti wa AKT.Hata hivyo, dhima muhimu ya SPECC1L katika ujanibishaji na uthabiti wa protini ya AKT bado haijafafanuliwa.
Kasoro kubwa katika mwonekano wa SPECC1L katika vivo ilisababisha kuongezeka kwa alama ya AJ na uwekeleaji wa CNCC wenye kasoro, pamoja na kuongezeka kwa apoptosis na kifo cha mapema cha kiinitete.Ripoti za awali zimeonyesha kuwa mabadiliko ya panya na viwango vya kuongezeka kwa apoptosis vinahusishwa na kasoro za neural tube 44,45,46,47 na kasoro za craniofacial48.Imependekezwa kuwa kifo cha seli nyingi katika mikunjo ya neva au matao ya koromeo kinaweza kusababisha idadi isiyo ya kutosha ya seli zinazohitajika kwa harakati sahihi ya morphogenetic 48,49,50.Kinyume chake, mistari yetu ya seli yenye upungufu wa SPECC1L yenye msemo uliopunguzwa kwa kiasi wa SPECC1L ilionyesha mabadiliko ya AJ pekee bila ushahidi wa kuongezeka kwa kifo cha seli.Walakini, kizuizi cha kemikali cha njia ya PI3K-AKT katika seli hizi za Kd kilisababisha apoptosis kuongezeka.Kwa hivyo, kupungua kwa wastani kwa usemi au utendakazi wa SPECC1L huhakikisha uhai wa seli.Hii inalingana na uchunguzi kwamba viinitete adimu vya Specc11 vinavyobadilika huepuka kukamatwa huko St.E9.5-labda kutokana na ufanisi mdogo wa kukamata jeni-wana uwezo wa kufunga mirija yao ya neva na kuacha baadaye katika maendeleo, mara nyingi na kasoro za craniofacial (Mchoro S3).Pia sanjari na hili ni kutokea nadra kwa viinitete vya heterozygous Specc1l vyenye matatizo ya fuvu-labda kutokana na kuongezeka kwa ufanisi wa kunasa jeni—pamoja na ugunduzi wa pundamilia ambapo mojawapo ya otholojia mbili za SPECC1L (specc1lb) husababisha kuchelewa kwa phenotypes ya kiinitete, ikiwa ni pamoja na kupoteza taya za chini na mipasuko baina ya nchi mbili51.Kwa hivyo, mabadiliko ya kupoteza kazi ya heterozygous SPECC1L yaliyotambuliwa kwa wagonjwa wa binadamu yanaweza kusababisha uharibifu mdogo katika kazi ya SPECC1L wakati wa morphogenesis ya craniofacial, kutosha kuelezea nyufa zao za orofacial.Udhibiti wa msingi wa SPECC1L wa mawasiliano kati ya seli unaweza pia kuwa na jukumu katika palatogenesis na muunganisho wa matao ya koromeo.Masomo zaidi ya utendakazi wa SPECC1L yatasaidia kufafanua jukumu la mawasiliano ya muda kati ya seli katika CNCC wakati wa kufungwa kwa neural tube katika neuroepithelial motility ya seli na craniofacial morphogenesis.
Udhibiti wa osteosarcoma wa U2OS na seli za SPECC1L-kd zimeelezwa hapo awali (Saadi et al., 2011).Kingamwili dhidi ya SPECC1L pia zimeainishwa hapo awali (Saadi et al., 2011).Kingamwili za anti-β-catenin (sungura; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (panya; 1:1000; Teknolojia ya Kuashiria Kiini, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis) ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Teknolojia ya Kuashiria kwa Simu, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ) , KI67 (1:1000; Teknolojia ya Kuashiria Kiini, Danvers, MA), iliyopasuka caspase 3 (1:1000; Teknolojia ya Kuashiria Kiini, Danvers, MA) na β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) ilitumika kama ilivyoelezwa..Filamenti za Actin zilitiwa madoa na Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Seli za udhibiti wa U2OS na seli za SPECC1L-kd zilikuzwa katika DMEM ya glukosi ya juu iliyoongezwa 10% ya seramu ya ng'ombe wa fetasi (Life Technologies, Carlsbad, CA).Kwa mabadiliko ya AJ, seli 2 x 105 zilipandwa kwenye glasi iliyotibiwa na gelatin ya nguruwe ya 0.1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) na kuzingatiwa kwa mabadiliko katika umbo la seli.Seli zilikusanywa kwa nyakati tofauti zilizoonyeshwa: masaa 4 baada ya kuota (t = 1), masaa 24 baada ya mbegu (t = 2), kuunganishwa bila mabadiliko katika umbo la seli (t = 3), mabadiliko ya umbo la seli (t = 4) , 24 h baada ya mabadiliko ya sura ya seli (t = 5) na 48 h baada ya mabadiliko ya sura ya seli (t = 6) (Mchoro 1, 2, 3).Ili kurekebisha njia ya PI3K-AKT, seli zilikuzwa katika viwango vilivyoainishwa kwa kutumia kizuizi cha PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) au kiwezeshaji cha SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Kiini kilicho na kemikali kilibadilishwa kila siku.
Rekodi za fremu kwa fremu zilifanywa kwa udhibiti wa moja kwa moja na seli za KD chini ya hali ya kawaida ya utamaduni, na picha za utofautishaji wa awamu zilikusanywa kila dakika 10 kwa siku 7.Picha zilipatikana kwa kutumia darubini iliyogeuzwa ya Leica DM IRB inayodhibitiwa na kompyuta iliyo na hatua ya mitambo na lengo la 10 × N-PLAN lililounganishwa kwenye kamera ya QImaging Retiga-SRV.Wakati wa kupiga picha, tamaduni za seli zilidumishwa kwa 37 ° C katika anga yenye unyevu na 5% CO2.
Laini mbili za chembechembe za jeni za mtego wa ES DTM096 na RRH048 kutoka Kituo cha Rasilimali za Kipanya cha Mkoa (UC Davis, CA) zilitumiwa kutengeneza laini za panya zenye upungufu wa Specc11, maalum Specc1lgtDTM096 na Specc1lgtRRH046.Kwa ufupi, seli 129/REJ ES zilidungwa kwenye blastocysts za C57BL6.Panya wa kiume wa chimeric walizalishwa na panya wa kike C57BL6 ili kutambua watoto walio na rangi ya koti ya agouti.Uwepo wa viingizi vya vekta ya mtego wa jeni ulitumiwa kutambua heterozigoti.Panya walihifadhiwa kwenye mandharinyuma mchanganyiko ya 129/REJ;C57BL6.Eneo la tovuti ya kupachika ya vekta ya mtego wa kijeni lilithibitishwa na RT-PCR, mpangilio wa jenomu, na ukamilishaji wa kinasaba (Mchoro wa Nyongeza 1).Ili kufuatilia ukoo wa CNCC wa panya wenye heterozygous Specc1lGT, ROSAmTmG (#007576) na Wnt1-Cre (#003829) panya (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) walivuka ili kuzalisha ROSAmTmG na Wnt1-Cre aleli katika Speccbryol mutant.Majaribio yote katika panya yalifanywa kulingana na itifaki zilizoidhinishwa na Kamati ya Kitaasisi ya Huduma na Matumizi ya Wanyama ya Chuo Kikuu cha Kansas Medical Center.
Viinitete viliwekwa ndani (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) kwa dakika 60 kwa joto la kawaida.Baada ya kurekebishwa katika myeyusho wa X-gal wa madoa (5 mm potassium ferricyanide, 5 mm ferrocyanide potasiamu, 2 mm MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Ukuzaji wa doa ulifanyika kwa 37°C. .°C ndani ya masaa 1-6.Viinitete viliwekwa baada ya 4% PFA na kuonyeshwa.
Kwa ukaushaji wa Magharibi, seli ziliwekwa kwenye bafa ya lisisi tulivu (Promega, Fitchburg, WI) iliyoongezwa kwa mchanganyiko wa vizuizi vya HALT protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates zilichakatwa kwenye 12% ya jeli ya Polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX iliyotengenezwa tayari (Bio-Rad, Hercules, CA) na kuhamishiwa kwenye membrane za Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Utando ulizuiliwa katika maziwa 5% katika PBS yenye 0.1% Kati.Kingamwili ziliwekwa ndani usiku kucha kwa 4°C au kwa saa moja kwa joto la kawaida.Kitendanishi cha Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) kilitumika kutengeneza mawimbi.Kwa kuzuia kinga, viinitete viliwekwa mara moja kwa 4% PFA/PBS na kuhifadhiwa kwenye cryopreserved.Ukataji wa tishu ulizuiwa katika PBS iliyo na 1% ya seramu ya mbuzi ya kawaida (Thermo Scientific, Waltham, MA) na 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) na kisha kuangaziwa kwa 4°C kwenye incubator wakati wa usiku.yenye kingamwili na kingamwili ya pili ya fluorescent (1:1000) kwa saa 1 kwa 4°C.Sehemu zilizo na madoa ziliwekwa katika sehemu ya dhahabu ya ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) na picha bapa zilipatikana kwa kutumia darubini ya Leica TCS SPE confocal.Kila uwekaji kinga mwilini ulifanywa kama majaribio matatu huru kwenye mipasuko ya angalau viini viwili vinavyobadilikabadilika.Jaribio la mwakilishi linaonyeshwa.
Seli ziliwekwa katika bafa ya RIPA iliyorekebishwa (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, na HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Kwa ufupi, lisaiti zilisafishwa kwa ushanga wa sumaku wa protini G (Life Technologies, Carlsbad, CA) na kisha kuangaziwa usiku kucha saa 4° C. kwa anti-SPECC1L au shanga za protini za IgG za protini G zilitumiwa kutoa SPECC1L na ukaushaji wa Magharibi ulifanywa kwa kutumia kizuia-SPECC1L -β-catenin kingamwili iliyoelezwa hapo juu Majaribio ya ushirikiano wa IP yaliyoonyeshwa yanawakilisha majaribio manne huru.
Seli zisizohamishika za kitamaduni au tishu za kiinitete cha panya zilitolewa kwa kituo cha hadubini ya elektroni katika Kituo cha Matibabu cha Chuo Kikuu cha Kansas.Kwa ufupi, sampuli zilipachikwa katika resin ya EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), kupolimishwa usiku kucha kwa nyuzijoto 60°C, na kugawanywa katika nm 80 kwa kutumia ultramicrotome ya Leica UC7 iliyo na blade ya almasi.Sehemu zilionyeshwa kwa kutumia darubini ya elektroni ya JEOL JEM-1400 iliyo na bunduki ya 100 kV Lab6.
Jinsi ya kutaja nakala hii: Wilson, NR et al.Upungufu wa SPECC1L husababisha kuongezeka kwa uthabiti wa viungo vilivyounganishwa na kupungua kwa delamination ya seli za neural crest.sayansi.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Uingizaji na utofautishaji wa neural crest.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Seli za neural crest ya cranial katika mwendo: jukumu lao katika ukuzaji wa uso wa fuvu.Jarida la Marekani la Jenetiki za Matibabu.Sehemu A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: ukuaji na maendeleo yake zaidi ya miaka 20.Daktari wa watoto.patholojia.maabara.dawa.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU na Noten MM Mafanikio katika jenetiki ya mipasuko ya orofacial.Mitindo ya Dawa ya Molekuli 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. na Riley, FM Taratibu za Molekuli za uhamiaji wa seli ya neural crest ya fuvu na muundo wakati wa ukuzaji wa uso wa fuvu.Maendeleo 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH na Murray, JK Cleft mdomo na kaakaa: kuelewa athari za kijeni na kimazingira.maoni ya asili.Jenetiki 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR na wengine.Mofogenesis isiyo ya kawaida ya ngozi, miguu na mikono na eneo la fuvu katika panya wenye upungufu wa interferon-6 (Irf6).Genette ya Taifa.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mabadiliko makubwa katika GRHL3 husababisha ugonjwa wa van der Word na kudhoofisha ukuaji wa periderm ya mdomo.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ na Juriloff, DM Sasisha orodha ya vibadilishaji panya vilivyo na kasoro katika kufungwa kwa mirija ya neva na maendeleo kuelekea uelewa kamili wa kinasaba wa kufungwa kwa mirija ya neva.Uchunguzi wa kasoro za kuzaliwa.Sehemu A, Teatolojia ya Kliniki na Masi 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling hudhibiti maisha na kuenea katika ukuaji wa mifupa kupitia njia ya ndani ya seli inayotegemea p53.Maendeleo ya Gene 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND na Murdoch, JN Disheveled: Uhusiano wa upanuzi wa kuunganika na kufungwa kwa neural tube.Mitindo ya Neurology.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).