Kipengele cha kemikali cha mirija ya chuma cha pua 347, Utambulisho wa riwaya ya antijeni-A (HLA-A) ya leukocyte ya binadamu inayojibu interferon kwa kutumia spectrometry ya molekuli iliyounganishwa (CLMS)

Asante kwa kutembelea Nature.com.Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Vitelezi vinavyoonyesha makala tatu kwa kila slaidi.Tumia vitufe vya nyuma na vinavyofuata ili kusogeza kwenye slaidi, au vitufe vya kidhibiti cha slaidi mwishoni ili kusogea kwenye kila slaidi.

Maelezo ya bidhaa

Mirija ya Coil ya Chuma cha pua 347L, Daraja la Chuma: SS347L

Mfumo wa kuashiria wa interferon huleta majibu yenye nguvu ya cytokine kwa aina mbalimbali za ishara za pathogenic na za ndani za patholojia kutoka kwa mazingira, na kusababisha uingizaji wa subsets ya protini zinazoweza kuingilia kati ya interferon.Tulitumia DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) ili kugundua mwingiliano mpya wa protini-protini katika kikoa cha protini zinazotokana na interferon.Kando na protini zinazoweza kuingizwa kwa interferon, tulitambua pia viambajengo riwaya vya intermolecular na intramolecular cross-linked cross-linked proteins canonical interferon-inducible proteins kama vile MX1, USP18, OAS3, na STAT1.Tuliangazia uthibitishaji wa othogonal wa seti ya riwaya ya mitandao ya protini inayoweza kuingizwa kwa interferon inayoundwa na protini za HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) kwa kutumia uundaji wa kinga pamoja na utafiti wao zaidi kwa kutumia uundaji wa mienendo ya molekuli.Uundaji wa mienendo ya upatanishi wa changamano ya protini ulifunua tovuti kadhaa za mwingiliano ambazo zilionyesha mwingiliano uliotambuliwa katika matokeo ya CLMS.Kwa pamoja, tunawasilisha uchunguzi wa majaribio wa CLMS ili kubaini miundo mipya ya kuashiria inayosababishwa na interferon, na tunatazamia matumizi mapana ya CLMS kutambua mienendo mipya ya mwingiliano wa protini katika mazingira madogo ya uvimbe.
Kabla ya mwitikio wa kinga ya kukabiliana na hali kuanza, mfumo wa ulinzi wa ndani wa mwenyeji huweka jibu la antimicrobial linalopatanishwa na familia ya saitokini za alpha-helical zilizofichwa zinazoitwa interferon (IFNs).Madarasa ya aina ya I IFN IFNα na IFNβ huwasha miitikio ya seli, ikijumuisha antiviral, proapoptotic, proinflammatory, na antiproliferative state.Kwa binadamu, aina ndogo 13 za IFNα zinajulikana, zote zikiwa zimeunganishwa kwenye kromosomu 91. Cha kushangaza ni kwamba IFNα2 pekee ndiyo imefanyiwa utafiti kwa matumizi ya kimatibabu.Hivi majuzi, umakini maalum umelipwa kwa utafiti juu ya aina zingine ndogo za IFNα.Utafiti wa hivi majuzi ulionyesha kuwa IFNα14 ni mojawapo ya isoforms bora zaidi katika kuzuia urudufishaji wa HBV2 na VVU-13,4 ikilinganishwa na aina ndogo ya IFNα2 ya kisheria.
Imethibitishwa kuwa chanjo za vipokezi vya interferon za aina ya I (IFNAR1 na IFNAR2) huanzisha mtiririko wa mawimbi unaopatanishwa na Janus kinases TYK2 na JAK15,6.Hizi Janus kinase vibadilishaji ishara vya phosphorylate na viamilisho vya protini vya transcriptional (STAT1 na STAT2) kwenye masalia ya tyrosine ili kuanzisha heterodimerization ya kikoa ya SH2.Baadaye, IRF9 hufunga heterodimers za STAT kuunda mchanganyiko wa trimeric wa jeni la IFN-stimulated factor 3 (ISGF3), ambayo huhamishwa hadi kwenye kiini na kushawishi unukuzi wa zaidi ya jeni 2000 zinazochochewa na interferon (ISGs)5,6,7,8.
ISGs huunda uti wa mgongo wa mfumo wa kinga ya ndani, haswa katika kukabiliana na shambulio la virusi.Kama njia ya kwanza ya ulinzi dhidi ya maambukizi ya virusi, seli hupeleka kwa haraka mwingiliano mkubwa wa protini za seli na shughuli nyingi za kibaolojia.Protini hizi ni pamoja na vipokezi vya utambuzi wa muundo, molekuli zinazoashiria, vipengele vya unukuzi, na protini zenye utendaji wa moja kwa moja wa kuzuia virusi, pamoja na vidhibiti hasi vya majibu ya kinga9.Taarifa nyingi kuhusu shughuli za ISG hutoka kwenye skrini zinazofanya kazi kwa kutumia skrini za kujieleza kupita kiasi10,11 au mbinu za kunyamazisha jeni (siRNA, RNAi na CRISPR)12,13 ambapo ISG za kibinafsi huonyeshwa au kuzuiwa na shughuli zao hujaribiwa kwenye virusi mbalimbali.Ingawa tafiti hizi zimebainisha sifa za kuzuia virusi vya ISG binafsi, mifumo ya msingi ya molekuli ya kila ISG bado haijulikani kwa kiasi kikubwa.Inakubalika kwa ujumla kuwa protini nyingi huingiliana na saitokini moja au zaidi ili kuhakikisha shughuli kamili, kwa hivyo aidha ISG zinaingiliana moja kwa moja au mwingiliano wao unapatanishwa na protini za seli.Kwa mfano, uchunguzi wa hivi majuzi wa proteomics uliounganishwa kwa picha ulibainisha ATPase VCP/p97 kama mshirika mkuu wa mwingiliano wa IFITM3, ambaye kizuizi chake husababisha kasoro katika upangaji wa lysosomal, mauzo, na usafirishaji wa pamoja wa IFITM3 yenye chembechembe za virusi 14.Kwa kutumia upungufu wa kinga mwilini, tulitambua VAPA, protini inayohusishwa na vesicle, kama mshirika wa mwingiliano na IFITM1/2/3 ambayo hupatanisha upevukaji wa virusi unaosababishwa na kolesteroli, na hili lilithibitishwa na utafiti mwingine unaotumia mfumo wa chachu wa mchanganyiko wa aina mbili.Usaidizi wa Kisayansi 15 , 16 .
Mchakato wa kimsingi wa kibayolojia unaohusika katika ukandamizaji wa maambukizi na mabadiliko mabaya ni uwasilishaji wa antijeni, ambao unapatanishwa na molekuli kuu za histocompatibility complex (MHC).Peptidi (asidi za amino 8-12 kwa muda mrefu) kutoka kwa protini zilizopasuka, zilizokatishwa mapema au zilizoharibika hupakiwa kwenye heterodimer ya MHC-I (inayojumuisha minyororo nzito na nyepesi ya MHC-I, inayoitwa β-2-microglobulin; β2M) 17,18.Vitatuzi dhabiti vya MHC-I vinavyotokana husafirishwa hadi kwenye uso wa seli, ambapo huwasilisha peptidi za ndani ya seli kwa seli za CD8+ T (seli za cytotoxic T)17.Seli T hutambua na kuharibu vimelea hivi na seli zinazobeba antijeni mahususi ya uvimbe.Kwa hivyo, vimelea vya magonjwa na seli za uvimbe mara nyingi hukandamiza mchakato wa uwasilishaji wa antijeni ili kuzuia ufuatiliaji wa kinga.Kwa kuongeza, MHC-I imepunguzwa katika 40-90% ya uvimbe wa binadamu na mara nyingi huhusishwa na ubashiri mbaya zaidi19.
Jeni zinazohusika katika kukabiliana na vimelea vya magonjwa lazima zibadilike haraka kati ya hali ya kupumzika na hali ya unukuzi amilifu.Kwa hiyo, protini kadhaa za seli hufikiriwa kuwa zinahusika katika kukabiliana na mahitaji ya juu ya IFN kwa muda mfupi, ikiwa ni pamoja na urekebishaji na urekebishaji wa mkuzaji wa chromatin 20,21.Tafiti nyingi zimezingatia utambuzi wa washirika binafsi wa protini wa ISG mbele ya IFN.Masomo kadhaa ya proteomic na transcriptomic katika mifumo ya seli ya mfano yamefafanua athari za IFN kwenye mazingira ya seli.Hata hivyo, licha ya uelewa unaokua wa mienendo inayosababishwa na interferon, bado tunajua kidogo kuhusu ushiriki wa ISGs.Wakati wa kuzingatia utata na mienendo inayotegemea wakati wa ishara ya interferon, maswali mawili hutokea: (i) inawezekana kuimarisha na kunasa tata za multiprotein zinazohusika katika kuashiria haraka, na (ii) je, mwingiliano huu unaweza kupangwa kwenye nafasi ya 3D?
Ili kushughulikia masuala haya, tulitekeleza disuccinimide-mediated kemikali cross-linking (DSS) pamoja na mass spectrometry (CLMS) ili kujifunza mtandao wa mwingiliano wa protini unaotokana na IFNα na mienendo yake.DSS huongeza vifungo shirikishi kati ya masalia ya karibu ya protini na/au changamano za protini katika maisha.Uchanganuzi uliofuata wa MS unaonyesha tovuti mahususi zinazounganisha zinazoonyesha ukaribu wa anga wa maeneo ndani ya protini fulani, inayoitwa miunganisho ya ndani, au vitengo vidogo katika muundo wa protini, unaoitwa uhusiano.Kwa kutumia mbinu hii, tumegundua tata kadhaa za riwaya za protini-protini pamoja na mitandao ya mwingiliano wa proteni nyingi zinazotokana na interferon.Kwa kujaribu zaidi kitengo kidogo cha mwingiliano huu mpya, tunaonyesha kuwa H2BFS (H2B histone-aina FS; ambayo itajulikana kama H2B) na MDN1 hufanya kama washirika wanaofunga HLA-A.
Seli za Flo-1 ni mojawapo ya miundo inayojulikana zaidi ya adenocarcinoma ya esophageal kwani huiga vipengele muhimu vya uvimbe wa umio22,23.Hata hivyo, si uvimbe wote ambao hauna kinga, na ili kubaini ikiwa seli za Flo-1 hujibu matibabu ya interferon, tulitibu seli za Flo-1 kwa 10 ng/ml IFNα kwa saa 72.Seli za Flo-1 zilionyesha kuingizwa mapema kwa pSTAT1 na IRF1, kuanzia saa 2 baada ya matibabu na kuendelea kwa saa 72, na kupungua kwa muda kwa viwango vya stationary vya IRF1 (Mchoro 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, na ISG15) zilipatikana kushawishiwa sana baada ya saa 6, zikiiga majibu ya awali ya awamu ya katikati na marehemu kwa IFNα (Mchoro 1A).Kwa pamoja, data hizi zinaonyesha kuwa mtindo huu wa seli unaweza kutumika kujifunza majibu ya interferon.
Majibu tofauti ya usemi wa protini katika seli za Flo-1 baada ya matibabu ya IFNα.(A) Usemi wa protini katika seli za Flo-1 zilizotibiwa kwa 10 ng/ml IFNα kwa saa 2, 6, 24, 48 na 72 zilichambuliwa na kingamwili kwa kutumia kingamwili za ISG zilizoonyeshwa.(B) Geli za SDS-PAGE za rangi ya samawati zilizotiwa doa za dondoo za seli nzima baada ya kuunganishwa na DSS kwa nyakati na viwango vilivyobainishwa.(C) Kingamwili kiwakilishi kilichochunguzwa na kingamwili p53(DO-1) kutoka kwa sampuli zilezile ili kutathmini kiwango cha uunganishaji wa protini.
Ili kunasa mazingira ya mwingiliano wa protini katika situ, tulitumia DSS, wakala wa kuunganisha mtambuka unaotumika sana kutokana na upenyezaji wa juu wa utando wake na muda mfupi wa kuitikia.Wakati mfupi wa majibu husaidia kuzuia uundaji wa miunganisho mikubwa ya protini zilizounganishwa, na hivyo kudumisha utulivu wa kiunganishi.Ili kubaini ukolezi bora wa DSS na kuepuka kuvuka-unganisha, kwanza tuliweka seli kwenye 5, 2.5, na 1 mM DSS kwa dakika 5, 10, 5, na 30, mtawalia, na kuchanganua lisati na SDS-PAGE iliyotiwa madoa ya Coomassie. (data haijaonyeshwa).Lisaiti za seli zinaonekana kuunganishwa sana katika mkusanyiko wa chini kabisa na kwa muda mfupi zaidi.Kwa hivyo, DSS ilipewa alama ya 1, 0.5, na 0.1 mm kwa zaidi ya dakika 5 (Mchoro 1B).Uunganishaji bora zaidi ulizingatiwa na 0.5 mM DSS kwa dakika 5, na masharti haya yalichaguliwa kwa seli zilizotibiwa kwa IFNα.Zaidi ya hayo, Kielelezo 1C kinaonyesha doa ya Magharibi iliyofanywa kwa kutumia kingamwili ya p53 (DO-1) ili kutathmini kiwango cha kuunganisha protini.
Seli za Flo-1 zilitibiwa kwa 10 ng/ml IFNα kwa saa 24 kabla ya kuongeza kiunganishi.Seli zilizounganishwa na msalaba hatimaye zilipigwa na proteolysis ya hatua mbili na protini zilichakatwa na FASP (Mchoro 2) 24,25.Peptidi za tryptic zilizounganishwa na msalaba zilichambuliwa na spectrometry ya molekuli (Mchoro 2).Kisha mwonekano wa MS/MS hulinganishwa na mfuatano wa protini na kukaguliwa na MaxQuant26,27.Peptidi zilizounganishwa na mtambuka zilitambuliwa kutoka kwa mwonekano uliopatikana kwa kutumia programu ya SIM-XL, na misombo ya mtu binafsi iliunganishwa kuwa mtandao changamano kwa kutumia xQuest28 na SIM-XL29 mabomba ya programu ya chanzo huria ya kompyuta (Mchoro 2).SIM-XL hutambua mwingiliano wa protini-protini, minyororo ya ndani na minyororo ya mtu binafsi katika mchanganyiko rahisi au changamano wa protini na hutoa hati za kuibua mwingiliano katika miundo ya protini.Kwa kuongezea, huweka kila marejeleo mtambuka kama alama ya kitambulisho kulingana na ubora wa wigo wa MS/MS29.Kadhaa ya kuaminika mwingiliano protini-protini na complexes wamekuwa kutambuliwa, na seti mpya ya mwingiliano imekuwa zaidi kuchunguzwa kwa kutumia ushirikiano immunoprecipitation na conformational mabadiliko ya complexes kutumia mienendo ya Masi (MD) modeling (Mchoro 2) 30, 31.
Muhtasari wa kimkakati wa mbinu ya CLMS.Seli za Flo-1 zilitibiwa kwa 10 ng/ml IFNα kwa saa 24 ikifuatiwa na uunganishaji wa protini katika situ kwa kutumia DSS ikifuatiwa na uchanganuzi wa seli na trypsinization.Sampuli zenye uhusiano mtambuka zilichanganuliwa kwa kutumia kipima sauti cha Orbitrap na kufanyiwa sampuli zaidi ili kugawanya vianzilishi vya peptidi wakati wa LC-MS/MS.Peptidi mbili zilizounganishwa zilitambuliwa kutoka kwa wigo uliopatikana kwa kutumia Mashine ya Utambuzi wa Spectrum ya programu ya Crosslinked Peptides (SIM-XL), na misombo yote iliunganishwa kuwa mtandao changamano kwa kutumia mabomba ya computational.Chuja mwingiliano wa chini wa kujiamini kulingana na alama chanya za uwongo (FDR).Mwingiliano kadhaa mpya wa uaminifu wa juu wa protini-protini ulithibitishwa zaidi kwa kutumia ushirikiano wa kinga, na mabadiliko ya conformational katika complexes yalichunguzwa kwa kutumia mfano wa mienendo ya molekuli (MD).
Jumla ya ~ 30,500 na ~ peptidi 28,500 ziligunduliwa kwa kutumia MaxQuant katika sampuli za IFNα zisizochochewa na zilizochochewa, mtawalia (Jedwali la Ziada S1, Mchoro 3A).Usambazaji wa urefu wa peptidi katika visa vyote viwili ulionyesha sehemu kubwa ya peptidi kubwa, ikionyesha uwepo wa peptidi zilizounganishwa (Mchoro 3B, C).Aidha, sehemu kubwa ya peptides kubwa walikuwa sasa katika mbalimbali 40-55 katika sampuli IFNα-kutibiwa (Mtini. 3C).Uchoraji ramani ya protini dhidi ya ukubwa wa log2 ulionyesha kuwa protini za asili zilizochangamshwa na interferon ndizo zilizokuwa nyingi zaidi ikilinganishwa na sampuli ambazo hazijatibiwa, zikiwemo MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, na HLA-F (Kielelezo 3D).Uchambuzi wa njia za protini zaidi ya mara tatu zilizorutubishwa katika kukabiliana na matibabu ya IFNα kwa kutumia hifadhidata ya njia ya Reactome ulionyesha kuwa uwasilishaji na usindikaji wa antijeni wa MHC-I-iliyopatanishwa ilikuwa njia kuu zaidi (Mchoro 3E).Kwa mujibu wa ripoti za awali, majibu ya antiviral yaliyopatanishwa na OAS na ISG15 pamoja na IFNα / β na ishara ya cytokine yalikuwa kati ya njia zilizoamilishwa.Kwa kuongeza, viungo vya protini ya lysine- na serine-maalum vya protini vilitambuliwa kutoka kwa spectra iliyopatikana ya MS/MS kwa kutumia SIM-XL.Utafiti wa hivi majuzi uliripoti ISGs 104 zinazochukua virusi 20 kutoka kwa madarasa 9 ya virusi kwa uchanganuzi wa meta wa tafiti za kuzidisha za ISG katika aina 5 za seli.Hata hivyo, ili kuondokana na vikwazo vya kimahesabu vya kukagua hifadhidata kubwa, tulianza na mkusanyiko mdogo wa data ili kuchunguza mwingiliano unaowezekana kati ya orodha ya jeni za IRDS zilizoripotiwa na Padaria et al., nyingi zikiwa ISG.
Utambulisho wa protini zilizounganishwa kwa njia tofauti katika kukabiliana na IFNα (data iliyopatikana kutoka MaxQuant).(A) Mchoro wa Venn unaowakilisha idadi ya peptidi za kawaida na za kipekee zilizotambuliwa katika sampuli za Flo-1 zilizotibiwa na zisizotibiwa za IFNα14.Usambazaji wa urefu wa peptidi wa sampuli zilizounganishwa (B) na IFNα zilizotibiwa (C) ambazo hazijatibiwa.(D) Ramani ya joto inayowakilisha log2 (kiwango cha LFQ) kati ya seli za Flo-1 ambazo hazijatibiwa na IFNα14 zilizotibiwa.Paneli ya kushoto inaonyesha protini zilizoamilishwa kikamilifu mbele ya IFNα.(E) Histogram inayowakilisha njia 20 kuu za uboreshaji baada ya matibabu ya IFNα.Hifadhidata ya njia ya Reactome ilichanganua zaidi ya mabadiliko mara nne katika protini zinazoweza kuitikia IFNα.
Kichocheo cha Interferon-mediated ISG kimeandikwa vyema, lakini katika kiwango cha molekuli haieleweki vizuri jinsi protini hizi huishia katika anuwai ya kazi za kibiolojia.Tulichunguza mwingiliano wa protini kwa uhakika wa hali ya juu kati ya ISG zinazojulikana.Inashangaza, tulitambua mtandao unaojumuisha MX1, USP18, ROBO1, OAS3, na STAT1 protini ambazo huunda tata kubwa katika kukabiliana na matibabu ya IFNα (Mchoro 4, Jedwali S2) 32,33,34.Muhimu zaidi, mwingiliano huu ulipatikana katika triplicates zote zilizotibiwa na IFNα na hazikupatikana katika sampuli ambazo hazijatibiwa, na kupendekeza kuwa ziliundwa mahsusi kwa kukabiliana na matibabu ya IFNα.Inajulikana kuwa STAT1 hudhibiti kwa maandishi usemi wa ISG hizi, lakini mwingiliano wake na ISG katika kiwango cha protini haujachunguzwa.Muundo wa kioo wa STAT1 ulionyesha kuwa kikoa chake cha helical (CCD) hakihusiki katika mwingiliano na DNA au protomers wakati wa kuunda dimers35.Hizi α-heli huunda muundo wa helix wa helix ambao hutoa eneo la uso wa hidrofili kwa mwingiliano kutokea 35 .Katika data yetu ya CLMS, tuliona kwamba mwingiliano mwingi na STAT1 ulitokea katika kikoa cha SH2 kilichotangulia CCD, kikoa cha kiunganishi, au mkia wa C-terminal (mabaki 700-708) (Mchoro 4A).Utafiti wa awali uliripoti kuwa USP18 inafunga kwa CCD na kikoa kinachofunga DNA (DBD) cha STAT2 na inaajiriwa kwa kitengo kidogo cha aina ya kipokezi cha interferon IFNAR2 ili kupatanisha kizuizi cha aina ya I ya interferon inayoashiria 24.Data yetu pia ilionyesha kuwa kikoa kichocheo cha USP18 hutangamana na STAT1 DBD (Mchoro 4A,D), ikipendekeza kuwa STAT1 na STAT2 zinaweza kuwa na jukumu katika kuvutia USP18 kwa IFNAR2.
Mtandao wa ISG wa protini-protini uliotambuliwa katika seli zilizounganishwa na kutibiwa kwa IFNα.(A) Mpango wa mwingiliano wa 2D unaoonyesha mwingiliano wa protini na protini (unaozalishwa katika mpango wa SIM-XL), na mistari inayowakilisha mwingiliano kati ya molekuli (mkato wa kiungo umewekwa hadi 3.5).Vikoa vya vitambulisho tofauti vimetiwa alama kwa rangi32: kikoa cha MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), na GED (569–660).Vikoa vya OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), na OAS1_C (903-108).Kikoa ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) na fn3 (777–864).Sehemu za STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), na STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kitazamaji cha mduara cha protini zilizounganishwa-mtambuka (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, na STAT1) zenye mwingiliano na mwingiliano wenye lebo ya bluu na nyekundu, mtawalia.Kizingiti cha kiungo cha msalaba kiliwekwa kwa 3.5.Mipangilio ya nukta huonyesha maeneo ya mwingiliano ya STAT1 na MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), na OAS3 (F), pamoja na maeneo ya mwingiliano ya K au S kati ya peptidi hizo mbili.Katika takwimu, kizingiti cha alama ya kiungo cha msalaba kinawekwa 3.0.(G) Tovuti mbalimbali za mwingiliano kati ya vikoa vya STAT1 na OAS3 DI vilivyowekwa juu zaidi kwenye miundo yao ya protini katika PyMol (mfumo wa picha za molekuli za PyMOL, toleo la 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 ( kitambulisho cha pdb: 1bf533) na OAS3 ( kitambulisho cha pdb: 4s3n34).) programu.
Isoforms mbili za USP18 zimeelezewa kwa wanadamu, protini ya urefu kamili ambayo iko kwenye kiini, na isoform isiyo na kikoa cha N-terminal, USP18-sf, ambayo inasambazwa sawasawa katika saitoplazimu na kiini 36.Kwa kuongeza, N-terminus ilitabiriwa kuwa haijaundwa na haihitaji shughuli za isopeptidase au kufunga kwa ISG1537.Mwingiliano mwingi ulioainishwa katika utafiti wetu ulikuwa kwenye mwisho wa N wa protini, na kupendekeza kuwa mwingiliano huu unahusisha urefu kamili wa USP18 (Mchoro 4A, D) na hivyo uwezekano wa kutokea kwenye kiini.Zaidi ya hayo, data yetu pia inaonyesha kuwa N-terminus ni maalum kwa mwingiliano wa protini-kwa-protini.Tovuti ya kumfunga IFNAR2 iko kati ya mabaki 312-368, na hasa, hakuna protini katika tata inayofunga eneo hili (Mchoro 4A) 37,38.Data hizi zilizochukuliwa pamoja zinaonyesha kuwa kikoa cha kuunganisha cha IFNAR2 kinatumiwa na protini ya kipokezi pekee.Kwa kuongeza, ni OAS3 na ROBO1 pekee ndizo zilipatikana kuhusishwa na vikoa vya juu vya N-terminus na IFNAR2 tovuti ya kuunganisha (Mchoro 4A).
ROBO1 ni ya jamii kuu ya immunoglobulini (Ig) ya molekuli za kuashiria transmembrane na inajumuisha vikoa vitano vya Ig na vikoa vitatu vya fibronectin (Fn) katika eneo la nje ya seli.Vikoa hivi vya ziada vya seli hufuatwa na eneo la utando-karibu na helix moja ya transmembrane 39. Eneo la intracellular lisilo na muundo liko kwenye C-terminus na lina motifs za mlolongo zilizohifadhiwa ambazo hupatanisha ufungaji wa protini39.Kanda inayoenea kutoka kwa asidi ya amino ~ 1100 hadi 1600 ina shida nyingi.Tuligundua kuwa MX1 inaingiliana na ROBO1 kupitia Ig, Fn, na vikoa vya ndani ya seli, wakati mwingiliano mwingi na STAT1 hutokea kati ya CCD, kikoa cha kiunganishi, na C-terminus ya ROBO1 (Mchoro 4A, E).Kwa upande mwingine, mwingiliano na mikoa ya kiunganishi ya DI, DIII, na OAS3 ilisambazwa kote kwenye protini ya ROBO1 (Mchoro 4A).
Familia ya protini ya oligoadenylate synthase (OAS) inakubali na kuifunga RNA (dsRNA) yenye nyuzi mbili ndani ya seli, hupitia mabadiliko ya kimaumbile, na kuunganisha oligoadenylates 2′,5′-zilizounganishwa (2-5 As) 40.Ilibainika kuwa kati ya OASs tatu, OAS3 inaonyesha mshikamano wa juu zaidi wa dsRNA na kuunganisha kiwango cha chini zaidi cha 2-5 As, ambacho kinaweza kuwezesha RNase L na hivyo kupunguza urudiaji wa virusi 41.Familia ya OAS ina vikoa vya uhamishaji wa nyukleotidi kama polimerasi (pol-β).Utafiti wa awali umeonyesha kuwa shughuli ya kichocheo ya kikoa cha C-terminal (DIII) inategemea kikoa kinachofunga dsRNA (DI), ambacho kinahitajika ili kuwezesha OAS342.Tuliona kuwa vikoa vya DI na DII vya OAS3 vinaingiliana na CCD na eneo dogo la makutano kati ya SH2 na STAT1 TAD (Mchoro 4A,F).Kufunika tovuti tofauti za kuunganisha kwenye muundo wa protini kulifunua mwingiliano kati ya β-laha na kitanzi cha DBD STAT1 na mfuko wazi au matundu yaliyoundwa na mabaki 60-75 katika kikoa cha DI cha OAS3 (Mchoro 4G).Mwelekeo wa protini katika changamano pia ulionyesha kuwa hakuna mwingiliano wowote na OAS3 ulioingilia uwezo wa kumfunga DNA wa kikoa chake cha DI (Mchoro S1A).Kwa kuongeza, kikoa cha N-terminal cha GTPase MX1 kinaingiliana kwa kiasi kikubwa na vikoa vya DI na DIII vya OAS3 (Mchoro 4A).Pia tuliona mwingiliano kati ya OAS1 na MX1 katika marudio yote matatu yaliyotibiwa na IFNα, ambapo kikoa kimoja cha OAS1 (pia kinatumika kwa kichochezi) kiliingiliana na vikoa vyote vitatu vya MX1 (Mchoro S2A,B).
Protini za MX ni sehemu ya familia kubwa ya GTPase zinazofanana na dynein ambazo zina kikoa cha N-terminal GTPase ambacho hufunga na kuhairisha GTP, kikoa cha kati ambacho hupatanisha mkusanyiko wa kibinafsi, na zipu ya C-terminal leucine inayofanya kazi kama GTPase (LZ). )domain effector domain25,43.MX1 hufunga kwa vitengo vidogo vya polima za virusi ili kuzuia unukuzi wa jeni la virusi43.Skrini iliyoripotiwa hapo awali ya chachu ya miseto miwili ilionyesha kuwa MX1 inayohusishwa na PIAS1 inazuia uanzishaji wa jeni iliyopatanishwa na STAT1 kwa kuzuia shughuli ya kuunganisha DNA na pia ina shughuli ya ligase ya SUMO E344,45.Hapa, tunaonyesha kuwa MX1 inafungamana na STAT1 (Kielelezo 4C,D), hata hivyo jinsi mwingiliano huu unavyoathiri uwashaji wa jeni unaopatana na STAT1 katika kukabiliana na IFNα inahitaji utafiti zaidi.Kwa kuongeza, tuligundua pia kwamba MX1 iliingiliana na IFIT3 na DDX60 katika marudio yote matatu yaliyotibiwa na IFNα (Mchoro S2C).
DDX60 ni helikosi ya saitoplazimu inayotokana na IFN ambayo imeripotiwa hapo awali kuchangia uharibifu wa RNA46 unaojitegemea wa RIG-I.Inaingiliana na RIG-I na kuamsha uashiriaji wake kwa njia maalum ya ligand 46. DDX60 inajumuisha kikoa cha helikosi cha DEXD/H-Box na kikoa cha helicase cha C-terminal ambacho hufunga virusi vya RNA na DNA47.Mwingiliano wake mwingi na MX1 na IFIT3 hutokea ndani ya mikoa mirefu ya N- na C-terminal bila vikoa vya kisheria au motifu (Mchoro S2E, F).Hata hivyo, MX1 pia inahusishwa na kikoa cha helicase cha DEXD/H-Box (Mchoro S2E).Protini za familia ya IFIT zina nakala sanjari za motifu mahususi ya helix-turn-helix inayoitwa kurudia tena kwa tetrapeptidi (TPR).IFIT3 ilipatikana kuwa moduli chanya ya kuashiria RIG-I na hivyo ni kijenzi cha tata ya MAVS.Kwa pamoja, data yetu inapendekeza kwamba IFIT3 na DDX60 huingiliana hasa katika eneo kati ya TPR 3–6 ya IFIT3 na inaweza kuwa na jukumu katika kuashiria kwa RIG-I/MAVS (Mchoro S2F).
Kwa kuzingatia kwamba uchunguzi wa proteome nzima ni wa kimahesabu, kisha tukakagua hifadhidata nzima ya binadamu ya UniProt kwa kuwepo kwa mojawapo ya marudio yaliyotibiwa na IFNα.Katika nakala hii, tulipata mitandao kadhaa ya mwingiliano inayotegemewa sana ya HLA-A.Uchambuzi wa njia za protini zilizotambuliwa na spectra ya MS/MS ilionyesha kuwa usindikaji na uwasilishaji wa antijeni wa MHC-I ndio njia kuu inayotokana na interferon (Mchoro 3D).Kwa hiyo, tulizingatia kujifunza mwingiliano wa protini wa molekuli za MHC-I kwa kiwango cha juu cha ujasiri katika sampuli zote zilizounganishwa.HLA ina vikoa α1, α2 na α3 na minyororo ya mwanga, na microglobulin β2 (β2m) ni protini ya chaperone ya mara kwa mara49.Mara baada ya kukusanyika katika retikulamu ya endoplasmic, HLA haina msimamo kwa kukosekana kwa ligandi za peptidi50.Mkondo wa kuunganisha peptidi huundwa na vikoa vya α1 na α2 vyenye polimofi nyingi na ambavyo havijapangiliwa katika umbo lisilo la peptidi na kikoa cha α351 cha polimorphic kidogo.Katika uwepo wa IFNα, tuligundua aina mbili za HLA-A: moja inaingiliana na HMGA1 na H2B (Mchoro 5, Jedwali S3) na nyingine inaingiliana na MDN1, LRCH4 na H2B (Mchoro 6).
IFNα hushawishi mtandao wa mwingiliano wa HLA-A na H2B (H2BFS) na HMGA1.(A) Mpangilio wa P2 (unaozalishwa katika programu ya SIM-XL) inayoonyesha aina tofauti za mwingiliano katika changamano cha H2B-HLA-A-HMGA1: kiunganishi (bluu), kiunganishi (nyekundu) na kiungo kimoja (nyeusi)..Vikoa vya vitambulisho tofauti vina msimbo wa rangi32: H2B (histone; 2–102) na MHC-I (MHC_1; 25–203, kikundi C1; 210–290 na MHC_I_C; 337–364).Kizingiti cha kiungo cha msalaba kiliwekwa kwa 3.5.Mipangilio ya nukta nundu huonyesha maeneo ya mwingiliano ya HLA-A na H2B (B) na HMGA1 (C), pamoja na maeneo ya mwingiliano ya K au S kati ya peptidi hizo mbili.Katika takwimu, kizingiti cha alama ya kiungo cha msalaba kinawekwa 3.0.(D) Uhusiano kati ya protini zilizoonyeshwa katika miundo ya protini za H2B, HLA-A, na HMGA1 katika mpango wa PyMOL.Miundo hii iliundwa kwa kutumia seva ya Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) na miundo ya violezo vya protini za H2B, HLA-A na HMGA1 zilikuwa 1kx552, 1kj349 na 2eze55, mtawalia.
IFNα hushawishi mtandao wa mwingiliano wa HLA-A na H2B (H2BFS), MDN1 na LRCH4.(A) Viungo vya ndani ya molekuli (nyekundu) na baina ya molekuli (bluu) vilivyowasilishwa kwenye ramani shirikishi ya 2D (iliyotolewa katika programu ya SIM-XL) huku MDN1 ikiwakilishwa kama mduara.Kizingiti cha kiungo cha msalaba kiliwekwa kwa 3.5.Vikoa vya vitambulisho tofauti vina msimbo wa rangi32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, kikundi C1; 210–290 na MHC_I_C; 337–364) na LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) na CH (535–641)).(B) Uhusiano kati ya protini zilizoonyeshwa katika miundo ya protini za H2B, HLA-A, LRCH4, na MDN1 katika programu ya PyMOL.Miundo hii iliundwa kwa kutumia seva ya Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) yenye miundo ya violezo 1kx552, 1kj349, 6hlu62 na 6i2665 kwa protini za H2B, HLA-A, LRCH4 na MDN1, kwa mtiririko huo.Viwanja vya nukta nundu vinavyoonyesha tovuti za mwingiliano wa K au S za HLA-A yenye H2B (C), LRCH4 (D), na MDN1 (E).Kwa viwanja, kizingiti cha alama ya kiungo-mwingi kiliwekwa kuwa 3.0.
Mbali na kudumisha uadilifu wa jenomu, histone H2B pia inahusika katika udhibiti wa unukuzi.Protini ya H2B ina kikoa kikuu cha histone (HFD) iliyoundwa na heli-alfa tatu zilizotenganishwa na vitanzi na mkia wa C-terminal 41,52.Zaidi ya mwingiliano na H2B hutokea katika α1 helix, ambayo hutoa trimerization na heterodimer HFD (Mchoro 5A, B).Ingawa lysini huhusika katika kuunganisha DNA, baadhi ya lisini pia ni maeneo mbadala ya acetylation au methylation.Kwa mfano, mabaki ya K43, K46, na K57 kutoka H2B hayahusiki katika kuunganisha DNA moja kwa moja, lakini ni shabaha za marekebisho mbalimbali ya baada ya unukuzi53.Vile vile, mabaki ya K44, K47, na K57 katika H2B yanaweza kuwa na jukumu mbadala mbele ya IFNα, ikiwa ni pamoja na mwingiliano na protini nyingine (Mchoro 5A, B).Kwa kuongezea, histone ya ziada ya kromosomu H2B huwezesha mwitikio wa kinga katika aina mbalimbali za seli, ikifanya kazi kama kihisi cha sitosoli ili kugundua vipande vya DNA (dsDNA) vilivyo na ncha mbili vinavyotokana na ajenti za kuambukiza au seli zilizoharibika54.Kwa uwepo wa virusi vya DNA, upungufu wa H2B ulizuia uzalishaji wa IFN-β na phosphorylation ya STAT154.H2B pia inajulikana kuingia na kutoka kwenye kiini haraka kuliko histones nyingine za msingi54.Mwingiliano wa H2B na MDN1 na LRCH4 pia ulizingatiwa katika sampuli zilizochaguliwa ambazo hazijatibiwa.Tuligundua kuwa HLA-A ilitangamana na H2B katika sampuli zote tatu zilizotibiwa na IFNα na katika sampuli moja ya marudio ambayo haijatibiwa.Data hizi zinaonyesha jukumu la H2B katika utendaji mbadala wa kisaikolojia usiotegemea udhibiti wa unukuzi.
HMGA1 (kikundi cha juu cha uhamaji AT-Hook 1), nukleoproteini ndogo iliyojaa asidi ya amino inayokuza magonjwa, imetambuliwa kwa kushirikiana na HLA-A.Ina mkia wa C-terminal yenye tindikali na DBD tatu tofauti zinazoitwa ndoano za AT kwa sababu zinafungamana na sehemu ndogo ya eneo lenye utajiri wa AT katika dsDNA55,56.Kufunga huku kunasababisha DNA kupinda au kunyooka, ikiruhusu vipengele vya unukuzi vya kanuni kufikia mfuatano wake wa makubaliano.Mkia wa C-terminal unaaminika kuhusika katika mwingiliano wa protini na protini na uajiri wa vipengele vya unukuzi, kwa kuwa vibadilishaji mabadiliko vya kufuta C-terminal haziwezi kuanzisha unukuzi57.Zaidi ya hayo, kikoa hiki kina tovuti kadhaa zilizohifadhiwa za phosphorylation ambazo zinajulikana substrates za kinase 58 .Tuliona mwingiliano wa HLA-A na H2B na HMGA1 nje ya kikoa cha C-terminal, na kupendekeza kuwa kikoa cha C-terminal kinatumiwa zaidi kwa kuunganisha kipengele cha unukuzi (Mchoro 5A, C).Protini za HMGA hushindana na histone H1 kwa kuunganisha kwa adapta DNA, na hivyo kuongeza ufikivu57.Vile vile, inaonekana kuwa HMGA itatangamana na histone H2B pamoja na DNA ya kiunganishi kwa kushindana na histone H1.HMGB1 hushawishi usemi wa HLA-A, -B, na -C katika seli za dendritic, na hivyo kusababisha kuwezesha59, lakini mwingiliano kati ya HMG na HLA haujaripotiwa hapo awali.Tuligundua kuwa HMGA1 huingiliana na vikoa α1 na α3 vya HLA-A, na mwingiliano mwingi nje ya 3 DBD yake (Mchoro 5A,C).Mikononi mwetu, HLA-A ilipatikana kuwa imejanibishwa kwenye kiini (data haijaonyeshwa), na ikizingatiwa kuwa H2B na HMGA1 pia ziko kwenye kiini, mwingiliano huu unaweza kutokea kwenye kiini.Viongezeo mahususi vilivyopimwa kati ya H2B, HLA-A, na HMGA1 vinaonyeshwa kwenye Mchoro 5D.
Mwingiliano mwingi wa HLA-A na protini zingine hufanyika ndani ya vikoa vyake α1 na α2 na kikoa kisicho na utaratibu cha C-terminal (Mchoro 6).Katika mojawapo ya mifano hii, tuligundua kuwa HLA-A huingiliana na mkia wa N-terminal ulioharibika wa LRCH4 (Mchoro 6A,D).LRCH4 inadhibiti uanzishaji wa TLR4 na uanzishaji wa saitokini ya LPS, na hivyo kurekebisha mwitikio wa asili wa kinga60,61.Ni protini ya utando yenye marudio tisa ya leucine-tajiri (LRRs) na motifu ya homolojia ya utulivu (CH) katika ectodomain yake, ikifuatiwa na kikoa cha transmembrane (TMD) 60, 62.Vikoa vya CH vimeripotiwa kupatanisha mwingiliano wa protini-protini 60.Kiasi cha amino asidi 300 kati ya kikoa cha LRR na CH kinaweza kufikiwa kwa kiasi lakini hakina mpangilio.Kulingana na kazi ya maeneo yenye matatizo kama wapatanishi wa mitandao ya protini-protini na usafiri wa vesicular 63 , tuligundua kuwa mwingiliano mwingi wa protini hutokea katika maeneo ambayo hayajachanganyika.Mwingiliano na MDN1 ulisambazwa katika urefu wote wa protini, ikijumuisha vikoa vya LRR1, LRR6, CH, na maeneo ya nasibu, huku H2B ikihusishwa zaidi na kikoa cha CH (Mchoro 6A, B).Kwa hakika, hakuna mwingiliano wowote uliojumuisha TMJ, ikipendekeza umaalumu wa mbinu ya CLMS (Mchoro 6A, B).
MDN1 pia imetambuliwa kama sehemu ya mtandao wa protini ya HLA-A (Mchoro 6A).Ni ya familia ya AAA ya protini (ATPases zinazohusiana na shughuli tofauti).Hiki ni kikoa sawa cha N-terminal AAA ambacho hupanga katika pete ya hexameric na kuondoa kipengele cha kuunganisha kutoka kwa kitengo cha 60S 64 cha ribosomal.inaonekana kuwa sawa na dynein64,65,66.Kwa kuongezea, eneo tajiri la Asp/Glu linafuatwa na kikoa cha MIDAS (tovuti inayotegemea ioni za chuma).Kutokana na saizi kubwa ya MDN1 (takriban amino asidi 5600) na homolojia yake ndogo yenye protini zilizosomwa vizuri, ni kidogo sana inayojulikana kuhusu muundo na utendaji wake kwa binadamu.Tulitambua HLA-A, H2B, na LRCH4 kama washirika wanaofunga MDN1 na tukafichua mwelekeo wao kama mchanganyiko wa protini katika PyMol (Mchoro 6A,B).Protini hizi tatu huingiliana na kikoa cha AAA, kikoa cha kiunganishi cha dynein, na ikiwezekana kikoa cha MIDAS MDN1.Katika ripoti ya awali, utakaso wa mshikamano wa protini za chambo ulibainisha MDN1 kama protini inayohusishwa na histone H2B67.Kwa kuongeza, utafiti wa hivi karibuni pia uliripoti mwingiliano kati ya MDN na HLA-B katika seli za HCT116 kwa kutumia spectrometry ya molekuli iliyosafishwa, kusaidia matokeo yetu68.Utambulisho wa tata hii katika sampuli zilizotibiwa na IFNα unapendekeza jukumu la MDN1 katika utoaji wa ishara za interferoni.
Kwa sababu chembechembe za jeni za HLA zina umbo la aina nyingi, tulitoa mfuatano wa usomaji wa ramani HLA-A, -B, na -C kutoka kwa data ya mpangilio wa RNA ya seli za Flo-1 (data haijaonyeshwa).Mfuatano wa peptidi unaolingana na usomaji wa mpangilio ulifunua tofauti kubwa kati ya HLA-A, -B, na -C katika maeneo ambayo peptidi zilizounganishwa zilipatikana katika HLA-A (Kielelezo S3).Zaidi ya hayo, hatukuona uunganishaji wa protini-kwa-protini wa molekuli za HLA-B/C na protini H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Hii inapendekeza kwamba mwingiliano wa protini unaopatikana kati ya HLA-A, MDN1, LRCH1 na HMGA1 ni mahususi wa HLA-A.Kwa kuongeza, uchanganuzi wa proteomic wa sampuli zisizounganishwa (Jedwali S4) ulionyesha kuwa HLA-A ina chanjo ya mfuatano wa juu ikilinganishwa na HLA-B au HLA-C.Peptidi zilizotambuliwa kwa HLA-A zilikuwa na nguvu nyingi katika sampuli zote zilizotibiwa na IFNα na ambazo hazijatibiwa.
Ili kuhakikisha kwamba mwingiliano uliotambuliwa hapa haukutokana na muunganisho mtambuka usio mahususi wa protini mbili katika ukaribu wa anga, tulithibitisha zaidi vipengele viwili vipya vinavyoingiliana vya HLA-A kwa kufanya majaribio ya uimarishaji wa kinga mwilini.Mwingiliano wa HLA-A na MDN1 ya asili na H2B iligunduliwa katika seli zote za Flo-1 zilizotibiwa na ambazo hazijatibiwa (Mchoro 7, Kielelezo S4).Tulithibitisha kuwa HLA-A ilinaswa na H2B katika chembe za kinga mwilini na kwamba uhusiano huu ulitokana na matibabu ya IFNα kwa kuwa HLA-A haikuwepo katika sampuli za kinga kutoka kwa seli ambazo hazijatibiwa (Mchoro 7A).Hata hivyo, data yetu inapendekeza kwamba IFNα inadhibiti kwa njia tofauti kuunganisha HLA-A kwa H2B na MDN1.IFNα hushawishi uhusiano kati ya H2B na HLA-A, lakini inapunguza uhusiano wake na MDN1.Tuligundua kuwa MDN1 ilihusishwa na HLA-A katika vidhibiti, na kuongezwa kwa IFNα kulipunguza mwingiliano huu bila kuingizwa kwa MDN1 na IFNα (Mchoro 7B,C).Kwa kuongeza, kinga dhidi ya HLA-A ilichukua H2B katika seli za A549 (Kielelezo S4), na kupendekeza kuwa mwingiliano huu hautegemei aina ya seli.Yakijumuishwa, matokeo haya yanaauni mwingiliano wa interferon-mediated wa HLA-A na H2B na MDN1.
HLA-A husafisha H2B na MDN1.Vizuia kingamwili vya H2B (A) na MDN1 (B) viwakilishi vya endojeni vilipunguzwa kinga kutoka kwa seli za Flo-1 zilizotibiwa na IFNα na kuchunguzwa kwa kingamwili zilizoonyeshwa.IgG ya panya na sungura ilitumika kama udhibiti hasi.(C) Kiasi (kinachoingiza) cha antijeni tofauti huonyeshwa na kingamwili zilizochunguzwa dhidi ya kingamwili zilizoonyeshwa, β-actin ilitumika kama udhibiti wa upakiaji.
Sifa za kimuundo za mojawapo ya mitandao iliyounganishwa yenye kutegemewa sana inayotokana na interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, ilichunguzwa.Tulitumia uundaji wa mienendo ya molekuli kama mbinu mbadala ya kuelewa mienendo ya upatanisho wa protini zinazohusika katika tata hii (Mchoro 8).Makisio kutoka kwa data ya CLMS yanapendekeza uwezekano wa upatanisho tofauti wa protini za H2B, HLA-A, na HMGA1.Kwa hiyo, miundo ifuatayo ya uwezo iliundwa kwa njia ya kutengenezea: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, na H2B-HLA-A-HMGA1.Skrini ya awali ya kuweka protini-protini kwa kutumia MOE (Mazingira ya Uendeshaji ya Molekuli; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) ilipendekeza miunganisho inayowezekana ambayo inatofautiana kati ya protini hizi (Mchoro 8A).Taswira ya tata ya protini ya docking ilifunua mwingiliano kadhaa na uwezekano wa kufanana (Mchoro 5A, 8).Kwa hivyo, uunganisho mmoja unaowezekana unaonyeshwa kwenye Mchoro 8A (wenye viunganishi vilivyo na alama) na ilitathminiwa zaidi kwa kutumia bomba la uundaji wa MD.Kwa kuongezea, kuunganishwa kwa H2B au HMGA1 kwa HLA-A huangazia mshikamano wa juu wa H2B kwa HLA-A (Mchoro 8A).
Mienendo ya upatanishi ya mitandao inayowezekana kati ya H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, na changamano H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Paneli ya kushoto ni ramani ya P2 (iliyotolewa katika programu ya SIM-XL) ya viunganishi vya intramolecular (nyekundu) na intermolecular (bluu) (mkato wa kiunganishi umewekwa kuwa 3.5).Kwa kuongeza, mabaki ya kuunganisha mtambuka yaliyotambuliwa yameandikwa kwenye miundo ya protini za H2B, HLA-A, na HMGA1.Uunganisho unaohusishwa wa protini hizi ulitolewa kwa kutumia bomba la kufungia lililotekelezwa katika kifurushi cha MOE.Paneli ya chini kushoto inaonyesha miunganisho mbalimbali inayowezekana ya changamano za H2B-HLA-A na HMGA1-HLA-A zenye viambata tofauti vya kumfunga protini-protini (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Mkengeuko wa kawaida (RMSD) wa nafasi za atomiki (bila kujumuisha atomi za hidrojeni) kwa kila muundo wa protini.(C) Mwingiliano wa dhamana ya protini-protini ya hidrojeni ya intermolecular kutoka kwa aina mbalimbali za simulated kuzingatia mwingiliano maalum wa muda ≥ 10 ns.Umbali wa kukatwa wa kipokezi cha wafadhili-h-bondi uliwekwa kuwa 3.5 Å, na pembe ya kukata kipokezi cha wafadhili-H iliwekwa kuwa ≥ 160°–180°.(D) Mabaki yaliyo na lebo yanayounda mwingiliano wa protini-protini ya HLA-A na wenzi wao husika, unaochukua ≥ ns 20, iliyotolewa kutoka kwa mchanganyiko wa dummy HLA-A-H2B na HLA-A-HMGA1.Miundo ya protini inawakilisha muundo wa wastani wa 100 ns MDS.(E) Mwingiliano kati ya changamano za HLA-A-H2B na HLA-A-HMGA1 ikilinganishwa na mwingiliano unaofuatiliwa na uigaji wa H2B-HLA zaidi ya ns 100 kulingana na tovuti ya mwingiliano ya K au S kati ya peptidi hizi mbili.Changamano /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Thamani ya kizingiti cha tathmini ya viungo vya msalaba iliwekwa kwa 3.0, na mwingiliano maalum kutoka kwa MDS kuchukua ≥ ns 10 ulizingatiwa.Miundo ya protini ilionyeshwa kwa kutumia BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) na vifurushi vya Mazingira ya Uendeshaji ya Molekuli (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Uthabiti wa molekuli za HLA-A baada ya muda (mkengeuko wa kawaida; RMSD au mkengeuko wa kawaida; RMSF) ulionyesha kuwa uwepo wa protini za H2B au HMGA1 katika changamano uliimarisha HLA-A (Mchoro 8B, Kielelezo S5).Protini ya HMGA1 inajifunga kwa nguvu kwenye tovuti ya B2M ya HLA-A, ikichochea uthabiti wa amino asidi za HLA-A katika changamano cha HLA-A-HMGA1 au H2B-HLA-A-HMGA1 (Mchoro 8B, Kielelezo S5).hasa, mabaki ya HLA ~60-90 na ~180-210 yalipatikana kuwa rahisi kunyumbulika mbele ya H2B (FIG. 8B).H2B na HMGA1 zilionyesha kumfunga bora kwa HLA-A katika mchanganyiko wa H2B-HLA-A-HMGA1 ikilinganishwa na kumfunga HLA-A kwa H2B au HMGA1 pekee (Mchoro 8C,D; Jedwali S5).Mabaki yanayohusika katika uunganishaji wa hidrojeni (MD ulio na muundo wa ukaaji wa juu ≥ ns 10) sanjari na tovuti za mwingiliano za CLMS (mabaki ya K au S) kwenye changamano, na kupendekeza kuwa mwingiliano uliotambuliwa na CLMS ni wa kutegemewa sana.Kuegemea (Mchoro 8E).Katika uundaji wa CLMS na MD, mabaki ya HLA-A kati ya takriban 190-210 na takriban 200-220 amino asidi yalipatikana ili kumfunga H2B na HMGA1, mtawalia (FIG. 8E).
Mwingiliano wa protini-protini huunda mitandao ya kimuundo yenye nguvu ambayo hupatanisha mawasiliano ya ndani ya seli kwa kukabiliana na uchochezi fulani.Kwa sababu mbinu nyingi za protini hutambua mabadiliko katika kiwango cha jumla cha hali thabiti ya protini, mienendo ya mwingiliano wa protini na protini huhitaji zana za ziada ili kunasa miingiliano inayofungamana, na CLMS ni zana mojawapo.Mfumo wa kuashiria wa interferon ni mtandao wa cytokine ambao huruhusu seli kukabiliana na aina mbalimbali za ishara za pathogenic za mazingira na za asili za patholojia, na kuhitimisha kwa uingizaji wa seti ndogo za protini zinazoweza kuingilia kati ya interferon.Tulitumia CLMS ili kubaini ikiwa mwingiliano mpya wa protini-protini unaweza kutambuliwa kati ya jopo la protini zinazotokana na interferon.Uchanganuzi wa uunganishaji mtambuka wa protini duniani katika muundo wa seli ya Flo-1 unaoitikia interferon ulitumiwa kunasa muundo wa protini.Uchimbaji wa peptidi za tryptic kutoka kwa seli zisizounganishwa na zilizounganishwa mtambuka huruhusu kuhesabu peptidi, uboreshaji wa njia, na usambazaji wa urefu wa peptidi kwa kiwango kilichobainishwa cha LFQ.Protini za canonical interferon-inducible zilitambuliwa kama udhibiti mzuri wa ndani, wakati nyongeza mpya za intermolecular na intramolecular cross-linked ya proteni za canonical interferon-inducible kama vile MX1, UP18, OAS3 na STAT1 zilizingatiwa.Vipengele mbalimbali vya kimuundo na mwingiliano katika maeneo ya utendaji vimechunguzwa.
Mwingiliano kati ya HLA-A, MDN1 na H2B uligunduliwa kwa kuzuia kinga katika seli za Flo-1 na A549 zilizotibiwa na kutotibiwa na IFNα.Matokeo yetu yanaangazia kuwa HLA-A huchanganyika na H2B kwa njia inayotegemea IFNα.Kazi yetu inawakilisha njia ya kupendeza ya uchunguzi zaidi wa ujanibishaji mwenza wa miundo hii miwili.Pia itakuwa ya kuvutia kupanua mbinu ya CLMS kwa jopo la mistari ya seli ili kutambua mwingiliano wa protini unaotegemea aina ya seli-feron.Hatimaye, tulitumia uundaji wa MD kama mbinu mbadala ya kuelewa mienendo ya upatanishi ya protini zinazohusika katika tata ya H2BFS-HLA-A-HMGA1, ambayo ilifuatilia mazungumzo ya intramolecular na intermolecular.Makisio kutoka kwa data ya CLMS yanapendekeza uwezekano wa miunganisho tofauti ya protini za H2BFS, HLA-A, na HMGA1.Uunganisho tofauti unaowezekana kati ya muundo huu wa protini wa kusimamisha ulifunua mwingiliano kadhaa sawa na ule uliozingatiwa katika mkusanyiko wa data wa CLMS.Mojawapo ya nguvu kuu za njia yetu ni kwamba inaruhusu utambuzi rahisi wa kuingiliana kwa jeni zenye umbo nyingi kama vile HLA, kwa hivyo itapendeza kusoma mwingiliano wa protini mahususi za HLA ambazo si rahisi kusoma.Kwa pamoja, data yetu inaonyesha kuwa CLMS inaweza kutumika kupanua uelewa wetu wa mitandao ya kuashiria inayotokana na interferon na kutoa msingi wa kusoma mifumo changamano zaidi ya seli katika mazingira ya uvimbe.
Seli za Flo-1 zilipatikana kutoka ATCC na kudumishwa katika DMEM (Gibco) zikisaidiwa na 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% ya seramu ya ng'ombe wa fetasi (Gibco) na kuhifadhiwa kwa 37°C na 5% CO2.Incubation.Seli zilikuzwa hadi kuunganishwa kwa 70-80% kabla ya kutibiwa na IFNα14 (iliyotengenezwa na Edinburgh Protein Production Facility).Kemikali na vitendanishi vingine vyote vilinunuliwa kutoka Sigma Aldrich isipokuwa kama ilivyoelezwa vinginevyo.
Seli za Flo-1 zilikuzwa katika sahani 6-visima na siku iliyofuata seli zilitibiwa na 10 ng/ml IFNα14 kwa masaa 24 hadi takriban 80% ya muunganisho.Seli zilioshwa mara tatu kwa PBS na kuunganishwa kwa DSS iliyotayarishwa upya (Thermo Fisher Scientific) (iliyoyeyushwa katika DMSO) katika PBS kwa dakika 5 kwa 37° C. hadi mkusanyiko wa mwisho wa 0.5 mm.Athari ya kuunganisha ya DSS ilibadilishwa na PBS na mabaki ya DSS ilizimwa kwa kuongeza 20 mm Tris (pH 8.0) katika PBS kwa dakika 15 kwa 37°C.Seli zilikusanywa kwa kukwangua na kukusanywa katika mirija ya kumfunga chini (Aksijeni).
Pellet ya seli ilikuwa na 300 µl ya bafa ya urea lysis (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) kwa dakika 30 kwa joto la kawaida na kutikiswa mara kwa mara.Hatua zote za uingizaji hewa zilitekelezwa kwa 14,000 xg kwa 8°C.Centrifuge lysate kwa dakika 10 na uhamishe supernatant kwenye tube mpya.Chembe zilizobaki za wazi ziliyeyushwa katika 150 μl ya bafa ya pili ya lysis (2 M urea, 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) kwa dakika 30 au zaidi hadi suluhisho la maji lenye homogeneous lilipopatikana.Lysate ilikuwa centrifuged kwa dakika 20 na supernatant ilichanganywa na lysate iliyopatikana katika hatua ya awali.Viwango vya protini vilitathminiwa kwa kutumia kipimo cha Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) kulingana na maagizo ya mtengenezaji kwa taratibu za microplate.Sampuli ziligandishwa haraka katika nitrojeni kioevu na kuhifadhiwa kwa -80 ° C.
Takriban 100 μg ya protini inayoweza kuyeyuka iliyounganishwa ilichakatwa kwa kutumia itifaki iliyorekebishwa ya utayarishaji wa sampuli ya mchujo (FASP) kama ilivyoelezwa na Wisniewski et al.69 Kwa ufupi, protini imeunganishwa na 200 µl ya bafa ya urea (8 M urea katika 0.1 M Tris, pH 8.5), iliyopigwa na kupunguzwa kwa nusu.Hatua zote za uingizaji hewa zilitekelezwa kwa 14,000 xg kwa 25°C.Nusu ya kwanza ya lysate ya protini iliyounganishwa na msalaba ilihamishiwa kwenye kifaa cha chujio cha 10 kDa Microcon centrifugal kilicho na membrane ya Ultracel-10 (Merck), ikifuatiwa na uwekaji katikati kwenye chujio kwa dakika 25.Kisha kuongeza nusu ya pili ya protini kwenye chujio na kurudia hatua sawa.Urejeshaji wa protini ulifanywa kwa kuongeza 100 μl ya 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hidrokloridi (TCEP) katika buffer ya urea.Uokoaji ulichochewa kwenye thermomixer kwa 600 rpm kwa dakika 30 kwa 37 ° C.Zaidi ya hayo, safu hiyo iliwekwa katikati na protini iliyopunguzwa iliyounganishwa ilitolewa kwa alkylated kwa kutumia 100 μl ya iodoacetamide ya 50 mm katika bafa ya urea.Mmenyuko wa alkylation ulifanyika kwa joto la kawaida kwa dakika 20 katika giza.Zungusha safu, osha kuta za safu mara 3 na 100 µl urea bafa, na kisha centrifuge.Operesheni sawa ilifanyika mara 3 kwa kutumia 100 μl ya 100 mM bicarbonate ya ammoniamu.Kabla ya trypsinization, badilisha bomba la mkusanyiko na mpya.Ongeza bafa ya usagaji chakula iliyo na 50 mM ammonium bicarbonate na 1 µl trypsin iliyoyeyushwa katika bafa ya trypsin (Promega).Uwiano wa trypsin na protini ulidumishwa kwa takriban 1:33, na athari za usagaji chakula ziliangaziwa usiku mmoja kwa 37° C. katika chumba chenye unyevunyevu.Peptidi iliyounganishwa ilitolewa kutoka kwa kichungi kwa kupenyeza katikati kwa dakika 25.Urejeshaji wa peptidi uliboreshwa kwa kuongeza 50 μl ya 0.5 M NaCl kwenye kichujio, ikifuatiwa na uwekaji katikati kwa dakika 25.
Safu wima za C18 Micro Spin (Kifaa cha Harvard) zilitumiwa kuondoa peptidi za tryptic zilizounganishwa na mtambuka kufuatia itifaki iliyoelezwa na Bouchal et al.70 pamoja na marekebisho madogo.Kwa ufupi, safu wima zinazozunguka za C18 ziliamilishwa kwa kuosha mara tatu kwa 0.1% ya asidi ya fomu (FA) katika asetonitrile (AcN) (Merck) na kuosha mara mbili kwa 0.1% FA.Safu hii ilitiwa maji kwa 0.1% FA kwa dakika 15.Pakia sampuli kwenye safu wima na uoshe mara 3 kwa 0.1% FA.Peptidi zilizoondolewa chumvi zilitolewa kwa mfuatano na upinde rangi kwa hatua kwa kutumia 50%, 80% na 100% AcN katika 0.1% FA.Sampuli zilikaushwa kwenye konteta ya SpeedVac Plus (Eppendorf) hadi kioevu kilichobaki kipotee kabisa.Peptidi zilizotolewa ziliyeyushwa katika 100 μl ya 0.08% ya asidi trifluoroacetic katika 2.5% AcN na viwango vilipimwa kwenye NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Takriban μg 1 ya peptidi iliyounganishwa kwa kila sampuli ilidungwa kwenye mfumo wa LC-MS/MS.
Peptidi zenye uhusiano mtambuka zilitenganishwa kwa mfumo wa UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) uliounganishwa kwenye spectrometa ya molekuli ya Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptidi zilizounganishwa zilikusanywa kwenye Kitambulisho cha 300 µm, urefu wa 5 mm µ-kabla ya safu wima ya C18 ya kunasa iliyopakiwa na sorbent ya C18 PepMap100 na 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Pakia mtiririko wa pampu uliowekwa kwa 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid iliyoyeyushwa katika 2.5% AcN.Peptidi zilizounganishwa na msalaba zilitenganishwa kwenye safu wima ya silika iliyochanganuliwa yenye kipenyo cha ndani cha 75 μm na urefu wa mm 150, iliyojaa sorbent ya 2 μm PepMap (Thermo Scientific).Awamu za rununu A na B zilijumuisha 0.1% FA katika maji na 0.1% FA katika asetonitrile, mtawalia.Mteremko huanza kwa 2.5% B na kuongezeka kwa mstari hadi 40% B kwa dakika 90, kisha hadi 90% B katika dakika 2 zinazofuata.Muundo wa awamu ya rununu ulidumishwa kwa 90% B kwa dakika 10 na kisha kupungua kwa mstari hadi 2.5% B kwa dakika 2.Safu ilisawazishwa kwa 2.5% B kwa dakika 8 kabla ya mzunguko unaofuata.Peptidi zilizounganishwa na msalaba zilizotolewa kutoka kwa safu ya uchanganuzi ziliwekwa ioni katika chanzo cha ioni ya nanoelectrospray (NSI) na kudungwa kwenye spectrometa ya wingi ya Exploris 480 (Thermo Scientific).
Kipimo cha wingi cha Orbitrap Exploris 480 kilifanya kazi katika hali chanya ya uunganisho wa data.Uchanganuzi kamili ulifanywa katika hali ya sehemu kwa azimio la 120,000 na mipangilio ya masafa kutoka m/z 350 Th hadi m/z 2000 Th.Lengo la kawaida la AGC liliwekwa kuwa 300% na muda wa juu zaidi wa kuingiza wa 50ms.Utambuzi wa kilele cha monoisotopiki umeanzishwa kwa peptidi.Kigezo cha kulegeza kikwazo kimewekwa kuwa kweli ikiwa vitangulizi vichache sana vimepatikana.Nguvu ya chini ya ioni ya kitangulizi iliwekwa kuwa 5.0e3 na hali ya malipo ya utangulizi hadi +8 zilijumuishwa katika majaribio.
Muda wa mzunguko kati ya uchanganuzi mkubwa katika hali ya uunganisho wa data umewekwa kuwa sekunde 2.5.Utengaji wa wingi unaobadilika uliwekwa kuwa sekunde 20 baada ya mgawanyiko wa kwanza wa ayoni ya utangulizi.Dirisha la kutengwa la mtangulizi liliwekwa kuwa 2 Th.Aina ya nishati ya mgongano iliyorekebishwa na hali ya nishati ya mgongano isiyobadilika ilichaguliwa katika uchanganuzi unaotegemea data wa MS/MS.Nishati ya mgongano imewekwa hadi 30%.Azimio la Orbitrap liliwekwa kuwa 15,000 na lengo la AGC hadi 100%.Muda wa juu zaidi wa kudunga sindano umewekwa kuwa milisekunde 60.
Kabla ya kufuatilia mtandao wa protini-protini katika sampuli zilizounganishwa, tulichakata faili mbichi kwa kutumia kifurushi cha MaxQuant (toleo la 1.6.12.0)26,27 ili kutambua peptidi/protini zinazoweza kufuatiliwa katika sampuli.Kwa kuongeza, uchambuzi sawa wa proteomic ulifanyika kwenye sampuli zisizounganishwa za Flo-1 zilizotibiwa na bila kutibiwa na IFNα.Data ya MS/MS ilitafutwa katika hifadhidata ya binadamu ya UniProt (www.uniprot.org) (iliyopakiwa tarehe 12 Agosti 2020, ina maingizo 75,093) kwa kutumia injini ya utafutaji iliyojengewa ndani ya Andromeda27.Utafutaji ulifanyika bila kuonyesha maalum ya enzyme na marekebisho mbalimbali ya deamidation (N, Q) na oxidation (M).Uvumilivu wa wingi wa mtangulizi uliwekwa kwa 20 ppm na ioni za bidhaa kwa 0.02 Da.Mkengeuko wa kwanza na wa juu zaidi wa wingi umewekwa kuwa 10 ppm.Upeo wa wingi wa peptidi uliwekwa kwa Da 4600 na ufanano wa mlolongo umewekwa kati ya 7 na 25 amino asidi (aa).Uchambuzi zaidi wa takwimu ulifanyika kwa kutumia programu ya Perseus (toleo la 1.6.10.45).Yaliyomo ya protini yalihesabiwa kwa kuhalalisha ukubwa wa spectral wa protini (ukali wa LFQ; hesabu isiyo na lebo)27 na viwango vya ukubwa vilibadilishwa kuwa Log2.Mkusanyiko wa kidaraja wa protini unaotambuliwa na ukubwa wa peptidi ulijengwa kwa kutumia kifurushi cha pheatmap (v1.0.12) katika R (v 4.1.2).Uchambuzi wa uboreshaji wa njia ulifanywa kwa kutumia hifadhidata ya njia ya Reactome kwa protini zilizotibiwa na IFNα ambazo ziliamilishwa zaidi ya mara nne ikilinganishwa na sampuli ambazo hazijatibiwa.
Utambulisho wa lysine (K) au viunganishi maalum vya kemikali vya serine (S) vya chembechembe za protini zinazofuatiliwa na LC-MS/MS ulifanywa kwa kutumia mashine ya kutambua spectroscopic (SIM-XL) kwa peptidi zilizounganishwa (SIM-XL)29.Kwanza, mwingiliano unaowezekana kati ya chembe za jeni zinazopinga uharibifu wa DNA (IRDS) zinazohusishwa na interferon (IFN) zilichunguzwa kwa kutumia hifadhidata ya protini ya IRDS iliyofafanuliwa katika Padariya et al.28.Kukagua masharti yote na marudio ya UniProt nzima ya binadamu ni ngumu kimahesabu, kwa hivyo hifadhidata nzima ya binadamu ya UniProt (www.uniprot.org) (iliyopakuliwa tarehe 12 Agosti 2020, ina maingizo 75,093) dhidi ya marudio yaliyotibiwa na IFNα.Moja ya vichujio vya mwingiliano wa uaminifu wa juu.Mwingiliano huu wa umuhimu wa juu uliopatikana ulipanuliwa na kujaribiwa katika marudio na masharti yote.
Katika SIM-XL, DSS ilitumika kwa crosslinker (XL) na mabadiliko ya uzito wa XL na mabadiliko ya uzito yaliwekwa kwa 138.06 na 156.07, kwa mtiririko huo.Maeneo yafuatayo ya athari ya kuunganisha yanazingatiwa: KK, KS na KN-TERM, bila ioni za ripota.Mtangulizi na kipande ppm ziliwekwa hadi 20 na kizingiti cha Xrea kiliwekwa kuwa 0.15.Trypsin ilionekana kuwa maalum kabisa, na njia ya kugawanyika kwa nguvu ya juu ya C-mtego (HCD) ilitekelezwa.Kiwango cha upunguzaji cha XCorr dynamic DB na idadi ya chini kabisa ya peptidi kwa upunguzaji wa DB unaobadilika uliwekwa kuwa 2.5 na 2, mtawalia.Vigezo vingine ni: uwezekano wa monoisotopu na kukata kwa bahati mbaya kilele, angalau mabaki 4 ya AA kwa kila uzi na chaji ya juu zaidi ya uzi, na maxima 3 ya migawanyiko iliyokosa.Ramani za 2D zilizounganishwa zilichanganuliwa katika (SIM-XL) na uwakilishi wa picha wa xQuest28 ulitumiwa kuunda ramani za 2D.Viunga vya protini kwenye miundo ya protini hutolewa katika PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, toleo la 2.0 Schrödinger, LLC).
Miundo ya muundo wa protini iliundwa kwa kutumia seva ya Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 kwa kutumia kanuni za uundaji wa homolojia na utekelezaji wa "Njia ya Markov iliyofichwa".Phyre2 inazalisha miundo ya kielelezo kulingana na upatanishi wa mfuatano na miundo inayojulikana ya protini.Kwa protini za H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, na MDN1, miundo ya violezo 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, na 6i2665 ilitumiwa.Kwa kuongeza, muundo wa AlphaFold71 MX1, UBP18 na ROBO1 pia ulizingatiwa.Muundo wa protini ulionekana kwa kutumia kifurushi cha BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) na kifurushi cha Mazingira ya Uendeshaji wa Molekuli (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).