347 12.7*1.24mm Mirija ya chuma cha pua iliyosongwa ,Utaratibu wa Molekuli wa ufindishaji wa tuli wa kielektroniki unaolandanishwa na mshikamano wa α-synucleini na tau

Asante kwa kutembelea Nature.com.Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Vitelezi vinavyoonyesha makala tatu kwa kila slaidi.Tumia vitufe vya nyuma na vinavyofuata ili kusogeza kwenye slaidi, au vitufe vya kidhibiti cha slaidi mwishoni ili kusogea kwenye kila slaidi.

347 Uainishaji wa Bomba la Chuma cha pua

347 12.7*1.24mm Mirija ya chuma cha pua iliyosongwa

Kipenyo cha Nje: 6.00 mm OD hadi 914.4 mm OD, Ukubwa hadi 24” NB inapatikana Ex-stock, OD Size Steel Tubes zinapatikana Ex-stock

Kiwango cha Unene wa Bomba la SS 347: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, n.k. (0.5-12mm) Au saizi isiyo ya kawaida ili kubinafsishwa inavyohitajika.

Aina: Mabomba ya SS 347 Yanayofumwa |Mabomba ya SS 347 ERW |SS 347 Mabomba ya Welded |Mabomba ya SS 347 |Mirija ya SS 347 CDW, Mabomba ya LSAW / yaliyoshonwa kwa kushona / Imechorwa upya

Fomu: SS 347 Round Pipes/ Tubes, SS 347 Square Pipes/ Tubes, SS 347 Rectangular Pipe/ Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 "U" Shape, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Urefu: Nasibu Moja, Nasibu Mbili & Mwisho wa Urefu Unaohitajika: Mwisho Safi, Mwisho Ulioimarishwa, Uliokanyagwa

Komesha Ulinzi: Kofia za Plastiki |Malipo ya Nje: 2B, No.4, No.1, Na.8 Mirror Finish kwa Mabomba ya Chuma cha pua, Maliza kulingana na Mahitaji ya mteja

Hali ya Uwasilishaji: Iliyokatwa na Kuchujwa, Imepozwa, Imeangaziwa, Imechorwa kwa Baridi

Ukaguzi, Ripoti za Mtihani: Vyeti vya Mtihani wa Kinu, EN 10204 3.1, Ripoti za Kemikali, Ripoti za Mitambo, Ripoti za Mtihani wa PMI, Ripoti za Ukaguzi wa Visual, Ripoti za Ukaguzi wa Wahusika wengine, Ripoti za Maabara Zilizoidhinishwa za NABL, Ripoti ya Mtihani wa uharibifu, Ripoti za Jaribio Zisizo Kuharibu

Ufungashaji: Imefungwa kwenye Sanduku za Mbao, Mifuko ya Plastiki, Vipande vya Chuma vilivyounganishwa, au kulingana na Maombi ya Wateja.

Specials: Ukubwa na Specifications nyingine zaidi ya hapo juu inaweza kutengenezwa kwa ombi

Safu ya Ukubwa wa Bomba la SS 347: 1/2 inchi NB, OD hadi inchi 24

ASTM A312 347: Bomba la austenitic lisilo na mshono na lililonyooka lililokusudiwa kwa halijoto ya juu na huduma ya babuzi kwa ujumla.Filler chuma hairuhusiwi wakati wa kulehemu.

ASTM A358 347: Muunganisho wa umeme uliochochewa bomba la austenitic kwa huduma ya kutu na/au joto la juu.Kwa kawaida bomba hadi inchi 8 pekee hutolewa kwa vipimo hivi.Ongezeko la chuma cha kujaza kinaruhusiwa wakati wa kulehemu.

ASTM A790 347: Bomba lisilo na mshono na la mshono ulionyooka lililochochewa la ferritic/austenitic (duplex) linalokusudiwa kwa huduma ya jumla ya babuzi, kwa msisitizo maalum wa upinzani dhidi ya mpasuko wa kutu.

ASTM A409 347: Muunganisho wa umeme wa mshono ulionyooka au wa mshono wa ond ulichomekezwa bomba kubwa la ukuta wa mwanga austenitic lenye kipenyo cha 14” hadi 30” lenye kuta Sch5S na Sch 10S kwa kutu na/au juu.

ASTM A376 347: Bomba la austenitic isiyo imefumwa kwa matumizi ya joto la juu.

ASTM A813 347: Mshono mmoja, bomba la austenitic lenye svetsade moja au mbili kwa joto la juu na matumizi ya jumla ya babuzi.

ASTM A814 347: Bomba la austenitic lililofungwa kwa kazi baridi kwa joto la juu na huduma ya jumla ya babuzi.

Muundo wa Kemikali wa Mabomba ya Chuma cha pua ya 347H

Sifa za Mitambo ya Bomba 347H ya Chuma cha pua

Mabomba ya Chuma cha pua 347H Sifa za Kimwili

Madaraja Sawa kwa Bomba la Chuma cha pua la 347H

Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation ni alama mahususi ya ugonjwa wa Parkinson na sinucleinopathies nyingine.Hivi majuzi, protini ya tau inayohusishwa kwa kawaida na ugonjwa wa Alzeima imehusishwa na ugonjwa wa αS na imepatikana kuwa na ujanibishaji katika mijumuisho yenye utajiri wa αS, ingawa utaratibu wa molekuli wa kuunganishwa kwa protini hizo mbili bado hauko wazi.Tunaripoti hapa kwamba awamu ya αS hutengana katika ufupishaji wa kioevu kupitia ufindishaji changamano wa kielektroniki na polipeptidi zenye chaji chanya kama vile tau.Kulingana na mshikamano wa αS kwa upolimishaji na kasi ya kupungua kwa valensi ya mtandao wa mgando, mabonge hupitia ugaji wa haraka au kushikana na kufuatiwa na mkusanyiko wa polepole wa amiloidi.Kwa kuchanganya msururu wa mbinu za hali ya juu za biofizikia, tuliweza kubainisha utengano wa awamu ya kioevu-kioevu αS/Tau na kutambua vipengele muhimu vinavyosababisha uundaji wa mijumuisho isiyo ya kawaida iliyo na protini zote mbili katika kibandiko cha protini kioevu.
Kando na sehemu za utando, utengano wa anga katika seli unaweza pia kupatikana kwa kuunda miili minene yenye wingi wa protini, kama kioevu inayoitwa biomolecular condensates au droplets, kupitia mchakato unaojulikana kama utengano wa awamu ya kioevu-kioevu (LLPS).Matone haya huundwa na mwingiliano wa muda mwingi, kwa kawaida kati ya protini au protini na RNA, na hufanya kazi mbalimbali katika karibu mifumo yote hai.Idadi kubwa ya protini zenye uwezo wa LLP zinaonyesha mlolongo wa utata wa chini ambao ni wenye shida sana katika asili na katika uundaji wa condensates ya biomolecular3,4,5.Tafiti nyingi za kimajaribio zimefichua hali ya kunyumbulika, mara nyingi isiyo na mpangilio, na yenye wingi wa protini zinazounda viunga hivi vya kioevu, ingawa ni machache sana yanayojulikana kuhusu viambishi mahususi vya molekuli ambavyo hudhibiti ukuaji na kukomaa kwa viunga hivi hadi kuwa thabiti zaidi. jimbo..
Data mpya inaunga mkono dhana kwamba LLPS isiyo sahihi inayoendeshwa na protini na ubadilishaji wa matone kuwa miundo thabiti inaweza kuwa njia muhimu za seli zinazoongoza kwa uundaji wa mijumuisho ya sumu isiyoyeyuka ambayo mara nyingi ni alama za magonjwa ya kuzorota.Protini nyingi zenye matatizo ya ndani (IDPs) zinazohusishwa na LLPS, mara nyingi zenye chaji nyingi na zinazonyumbulika, zimehusishwa kwa muda mrefu na kuzorota kwa mfumo wa neva kupitia mchakato wa mkusanyiko wa amiloidi.Hasa, IDP ya biomolekuli hubanisha kama vile FUS7 au TDP-438 au protini zilizo na vikoa vikubwa vya uchangamano kama vile hnRNPA19 zimeonyeshwa kuzeeka na kuwa aina zinazofanana na jeli au hata ngumu kupitia mchakato unaoitwa umiminikaji.kiwanja.kwa mpito wa awamu dhabiti (LSPT) kama utendaji wa wakati au kwa kukabiliana na marekebisho fulani ya baada ya kutafsiri au mabadiliko muhimu ya kiafya1,7.
IDP nyingine inayohusishwa na LLPS katika vivo ni Tau, protini iliyoharibika inayohusishwa na mikrotubuli ambayo muunganisho wa amiloidi umehusishwa katika ugonjwa wa Alzeima10 lakini pia hivi karibuni umehusishwa na ugonjwa wa Parkinson (PD) na protiniopathies nyingine za nyuklia za sinepsi 11, 12, 13 zinahusiana.Tau imeonyeshwa kujitenga na suluhu/saitoplazimu moja kwa moja kutokana na mwingiliano mzuri wa kielektroniki14, na kusababisha uundaji wa matone yaliyoboreshwa ya tau yanayojulikana kama coacervates za kielektroniki.Imeonekana pia kwamba aina hii ya mwingiliano usio maalum ndiyo nguvu inayoendesha nyuma ya condensates nyingi za biomolecular katika asili15.Kwa upande wa protini ya tau, muunganisho wa kielektroniki unaweza kuundwa kwa mjumuisho rahisi, ambapo sehemu zenye chaji kinyume cha protini huchochea mchakato wa mpasuko, au kwa mkusanyo changamano kupitia mwingiliano na polima zenye chaji hasi kama vile RNA.
Hivi majuzi, α-synuclein (αS), Amiloidi IDP inayohusishwa na PD na magonjwa mengine ya mfumo wa neva yanayojulikana kwa pamoja kama synucleinopathy17,18, imeonyeshwa katika mifano ya seli na wanyama19,20 iliyokolezwa katika condensates ya protini na tabia kama ya maji.Uchunguzi wa kimatibabu umeonyesha kuwa αS hupitia LLPS kwa kujumlishwa kwa urahisi kupitia mwingiliano wa haidrofobu, ingawa mchakato huu unahitaji viwango vya juu vya protini na nyakati za incubation ndefu isiyo ya kawaida19,21.Iwapo viunga vilivyo na αS vinavyozingatiwa katika vivo vinaundwa na mchakato huu au mwingine wa LLPS bado ni suala kuu ambalo halijatatuliwa.Vile vile, ingawa muunganisho wa amiloidi wa αS umezingatiwa katika niuroni katika PD na sinucleinopathies nyingine, utaratibu kamili ambao αS hupitia mkusanyo wa amiloidi ndani ya seli bado hauko wazi, kwani kujieleza kupita kiasi kwa protini hii hakuonekani kuanzisha mchakato huu peke yake.Uharibifu wa ziada wa seli mara nyingi unahitajika, na kupendekeza kuwa maeneo fulani ya seli au mazingira madogo yanahitajika kwa ajili ya kurejesha mikusanyiko ya αS amyloid ndani ya seli.Mazingira moja ya seli ambayo huathirika hasa na mkusanyiko yanaweza kuwa ya ndani ya condensate ya protini 23 .
Jambo la kufurahisha ni kwamba, αS na tau zimepatikana kushirikiana katika ujumuishaji wa ugonjwa wa tabia kwa wanadamu walio na ugonjwa wa Parkinson na sinucleinopathies 24,25 na majaribio yameripoti uhusiano wa kiafya kati ya protini mbili 26,27 kupendekeza uhusiano unaowezekana kati ya mkusanyiko αS na. tau katika magonjwa ya neurodegenerative.ugonjwa.αS na tau zimepatikana kuingiliana na kukuza mkusanyiko wa kila mmoja katika vitro na katika vivo 28,29 na mijumuisho tofauti inayojumuisha protini hizi mbili imezingatiwa katika akili za wagonjwa wenye synucleinopathies 30 .Hata hivyo, machache yanajulikana kuhusu msingi wa molekuli ya mwingiliano kati ya αS na tau na utaratibu wa ujumlishaji wake.αS imeripotiwa kuingiliana na tau kupitia mvuto wa kielektroniki kati ya eneo la C-terminal yenye chaji hasi zaidi ya αS na eneo la kati lenye utajiri wa proline la tau, ambalo pia limerutubishwa katika mabaki yenye chaji chanya.
Katika utafiti huu, tunaonyesha kwamba αS inaweza kweli kujitenga na kuwa matone kupitia ufindishaji changamano wa kielektroniki kukiwa na protini ya tau, tofauti na mwingiliano wake na polipeptidi zenye chaji chanya kama vile poly-L-lysine (pLK), na katika mchakato huu .αS hufanya kama molekuli ya kiunzi kwa mtandao wa matone.Tumetambua tofauti zinazoonekana katika mchakato wa kukomaa kwa coacervates za αS za kielektroniki, ambazo zinahusishwa na tofauti za valency na nguvu ya mwingiliano wa protini zinazohusika katika mtandao wa coacervate.Jambo la kufurahisha ni kwamba tuliona mjumuisho wa αS na protini za tau amiloidi katika viambatisho vya kioevu vilivyodumu kwa muda mrefu na tukatambua baadhi ya vipengele muhimu vinavyosababisha mjumuisho wa protini hizi mbili katika viambatisho hivyo.Hapa tunaelezea kwa undani mchakato huu, ambayo ni uwezekano wa utaratibu wa molekuli msingi wa ukoloni wa protini mbili katika inclusions maalum za ugonjwa.
αS ina mkia wa C-terminal usio na anionic katika pH upande wowote (Kielelezo 1a), na tulikisia kwamba inaweza kupitia LLPS kupitia msongamano wa changamano za kielektroniki na molekuli za polipeptidi zilizoharibika.Tulitumia mabaki 100 ya poly-L-lysine (pLK) kama molekuli ya kielelezo cha kuanzia kwa sababu ya hali ya polima iliyochajiwa vyema na iliyochanganyikiwa katika pH 32 isiyo na upande. Kwanza, tulithibitisha kuwa pLK huingiliana na kikoa cha Ct cha αS kupitia skrini ya NMR ya Suluhisho. (Mchoro 1b) kwa kutumia 13C/15N-iliyoandikwa αS kukiwa na ongezeko la uwiano wa αS:pLK wa molar.Mwingiliano wa pLK na kikoa cha Ct cha αS hujidhihirisha katika kuvuruga kwa mabadiliko ya kemikali na kupungua kwa kiwango cha kilele katika eneo hili la protini.Inafurahisha, tulipochanganya αS na pLK katika mkusanyiko wa αS wa takriban.5–25 µM mbele ya polyethilini glikoli (5–15% PEG-8) (kawaida bafa ya LLPS: 10 mm HEPES pH 7.4, 100 mm NaCl, 15% PEG-8) mara moja tulipitia uwanja mpana wa uundaji wa protini. .droplets walikuwa aliona kwa kutumia fluorescence (WF) na mkali-shamba (BF) hadubini (Mtini. 1c).Matone 1-5 µm yaliyo na αS iliyokolea (imeongezwa 1 µM AlexaFluor488-iliyoandikwa αS, AF488-αS), sifa zake za kielektroniki zinaweza kutolewa kutokana na upinzani wao kwa 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) na unyeti wake kwa ongezeko la mkusanyiko wa NaCl (Mchoro 1c).Asili ya maji-kama ya coacervates ya αS/pLK changamani ya kielektroniki inaonyeshwa na uwezo wao wa kuunganisha ndani ya milisekunde (Mchoro 1d).Kwa kutumia turbidimetry, tulikadiria uundaji wa matone chini ya hali hizi, tulithibitisha asili ya kielektroniki ya mwingiliano mkuu unaohusishwa na uthabiti wake (Mchoro 1e), na kutathmini athari za uwiano mbalimbali wa polima kwenye mchakato wa LLPS (Mchoro 1f).Ingawa uundaji wa matone huzingatiwa juu ya anuwai ya uwiano wa polima, mchakato huo ni mzuri sana wakati pLK inazidi αS.LLP pia zimezingatiwa kwa kutumia kikali tofauti cha kemikali cha dextran-70 (kDa 70) au kutumia miundo mbalimbali ya sampuli, ikiwa ni pamoja na matone ya slaidi ya kioo, visima vidogo vya nyenzo mbalimbali, Eppendorf au kapilari za quartz.
uwakilishi wa Kiratibu wa maeneo tofauti ya protini katika vibadala vya WT-αS na ΔCt-αS vilivyotumika katika utafiti huu.Kikoa cha N-terminal cha amphipathiki, eneo la uundaji wa amiloidi haidrofobi (NAC), na kikoa cha C-terminal kilicho na chaji hasi huonyeshwa kwa rangi ya buluu, chungwa na nyekundu, mtawalia.Ramani ya Net Charge Per Residual (NCPR) ya WT-αS imeonyeshwa.b Uchambuzi wa NMR wa mwingiliano wa αS/pLK kwa kutokuwepo kwa makundi ya macromolecular.Kadiri mkusanyiko wa pLK unavyoongezeka ( αS: pLK uwiano wa molar wa 1:0.5, 1:1.5, na 1:10 huonyeshwa kwa kijani kibichi, kijani kibichi na kijani kibichi mtawalia).c Coacervate αS/pLK (uwiano wa molar 1:10) katika 25 µM (1 µM AF488-iliyoandikwa αS au Atto647N-iliyoandikwa pLK kwa picha ya WF) katika bafa ya LLPS (juu) au kuongezwa na 500 mM NaCl (chini 1 kushoto au baada) % 1,6-hexanediol (1,6-HD; kulia chini).Upau wa kipimo = 20 µm.d Mwakilishi wa picha za microscopic za BF droplet fusion ya αS/pLK (uwiano wa molar 1:10) katika mkusanyiko wa 25 μM;mishale inaonyesha kuunganishwa kwa matone ya mtu binafsi (mishale nyekundu na ya njano) kwenye tone jipya (kishale cha machungwa) ndani ya 200 ms).Upau wa mizani = 20 µm.e Mwangaza wa kutawanya (katika nm 350) mkusanyo wa αS/pLK katika bafa ya LLPS kabla na baada ya kuongezwa kwa 500 mM NaCl au 10% 1,6-HD katika 25 µM αS (N = sampuli 3 za nakala, wastani na mkengeuko wa kawaida pia umeonyeshwa).f Picha ya BF (juu) na uchanganuzi wa kutawanya mwanga (katika 350 nm, chini) ya mkusanyo wa αS/pLK katika 25 μM αS na kuongezeka kwa uwiano wa αS: pLK molar (N = 3 sampuli replicates, wastani na kupotoka kiwango pia unahitajika).Upau wa kipimo = 10 µm.Upau wa kipimo kwenye picha moja unaonyesha ukubwa wa picha zote kwenye paneli moja.Data ghafi hutolewa katika mfumo wa faili ghafi za data.
Kulingana na uchunguzi wetu wa ufindishaji changamano wa αS/pLK na uchunguzi wa awali wa αS kama molekuli mteja wa tau/RNA ufupishaji kupitia mwingiliano wa moja kwa moja na tau31, tulikisia kwamba αS na tau zinaweza kutenganisha na kutengenezea kwa kukosekana kwa RNA. condensation.kupitia miundo ya kielektroniki, na αS ni protini kiunzi katika αS/Tau coacervates (tazama usambazaji wa malipo ya tau kwenye Mchoro 2e).Tuliona kwamba wakati 10 μM αS na 10 μM Tau441 (iliyo na 1 μM AF488-αS na 1 μM Atto647N-Tau, mtawalia) zilichanganywa pamoja katika bafa ya LLPS, ziliunda miunganisho ya protini iliyo na protini zote kwa urahisi, kama inavyoonekana na hadubini ya WF.(Mchoro 2a).Colocalization ya protini mbili katika matone ilithibitishwa na darubini ya confocal (CF) (Mchoro wa ziada wa 1a).Tabia kama hiyo ilizingatiwa wakati dextran-70 ilitumiwa kama wakala wa mkusanyiko (Mchoro wa ziada wa 1c).Kwa kutumia PEG yenye lebo ya FITC au dextran, tuligundua kuwa mawakala wote wa msongamano walisambazwa sawasawa kwenye sampuli zote, zisizoonyesha utengano wala uhusiano (Mchoro wa Nyongeza. 1d).Badala yake, inapendekeza kwamba katika mfumo huu wanakuza utengano wa awamu kupitia athari za msongamano wa macromolecular, kwa kuwa PEG ni wakala wa msongamano uliopendekezwa, kama inavyoonekana katika mifumo mingine ya LLP33,34.Matone haya yenye utajiri wa protini yalikuwa nyeti kwa NaCl (1 M) lakini si kwa 1,6-HD (10% v/v), kuthibitisha sifa zao za kielektroniki (Mchoro wa Nyongeza 2a, b).Tabia yao ya ugiligili ilithibitishwa kwa kuangalia matukio ya kuunganisha matone ya milisekunde kwa kutumia hadubini ya BF (Mchoro 2b).
picha za hadubini za Confocal (CF) za αS/Tau441 huganda katika bafa ya LLPS (10 μM ya kila protini, 0.5 μM ya AF488 iliyoandikwa αS na Atto647N iliyoandikwa Tau441).b Picha wakilishi za uingiliano wa tofauti (DIC) za matukio ya muunganisho wa matone ya αS/Tau441 (10 μM kwa kila protini).c Mchoro wa awamu kulingana na mtawanyiko wa mwanga (katika nm 350) wa Tau441 LLPS (0–15 µM) bila kuwepo (kushoto) au kuwepo (kulia) kwa 50 µM αS.Rangi za joto zinaonyesha kutawanyika zaidi.d Kutawanya kwa mwanga wa sampuli za αS/Tau441 LLPS na kuongezeka kwa ukolezi wa αS (Tau441 katika 5 µM, N = marudio ya sampuli 2-3 kama ilivyoonyeshwa).e Uwakilishi wa kimkakati wa baadhi ya vibadala vya protini tau na maeneo tofauti ya protini iliyotumika katika utafiti huu: kikoa cha N-terminal kilicho na chaji hasi (nyekundu), eneo lenye utajiri wa proline (bluu), kikoa cha kuunganisha mikrotubu (MTBD, iliyoangaziwa kwa chungwa), na ond ya amiloidi-kutengeneza.mikoa ya filamenti (PHF) iliyoko ndani ya MTBD (kijivu).Ramani ya Net Charge Per Residue (NCPR) ya Tau441 imeonyeshwa.f Kwa kutumia 1 µM AF488 yenye lebo αS na Atto647N-iliyoandikwa ΔNt-, kwa kutumia 1 µM AF488 yenye lebo αS au ΔCt-αS mbele ya ΔNt-Tau (juu, 10 µM kwa kila protini) au K18 (chini µM5 kwa kila protini ) ) ) maikrografu za WF zilizofupishwa katika LLPS au bafa ya K18.Pau za mizani katika picha moja zinawakilisha ukubwa wa picha zote kwenye paneli moja (20 µm kwa paneli a, b na f).Data ghafi ya paneli c na d hutolewa kama faili ghafi za data.
Ili kupima jukumu la αS katika mchakato huu wa LLPS, tulichunguza kwanza athari za αS kwenye uthabiti wa matone kwa nephelometry kwa kutumia viwango vinavyoongezeka vya NaCl (Mchoro 2c).Kadiri mkusanyiko wa chumvi kwenye sampuli zilizo na αS unavyoongezeka, ndivyo viwango vya juu vya kutawanya mwanga (saa 350 nm), ambayo inaonyesha jukumu la kuleta utulivu la αS katika mfumo huu wa LLPS.Athari sawa inaweza kuzingatiwa kwa kuongeza ukolezi wa αS (na hivyo uwiano wa αS:Tau441) hadi takriban.Ongezeko la mara 10 kuhusiana na ukolezi wa tau (5 µM) (Mchoro 2d).Ili kuonyesha kwamba αS ni protini ya kiunzi katika coacervates, tuliamua kuchunguza tabia ya mutant ya Tau iliyovurugika ya LLPS, ambayo haina eneo lenye chaji hasi ya N-terminal (mabaki 1-150, ona Mtini. 2e) inayoitwa ΔNt-Tau.Hadubini ya WF na nephelometry ilithibitisha kwamba ΔNt-Tau yenyewe haikupitia LLPS (Mchoro 2f na Mchoro wa Nyongeza 2d), kama ilivyoripotiwa hapo awali 14. Hata hivyo, wakati αS ilipoongezwa kwa ufumbuzi wa mtawanyiko wa lahaja hii iliyopunguzwa ya Tau, mchakato wa LLPS ulikuwa kabisa. kurejeshwa kwa msongamano wa matone karibu na msongamano wa matone ya miyeyusho ya ukubwa kamili wa Tau na αS chini ya hali sawa na viwango vya protini.Utaratibu huu pia unaweza kuzingatiwa chini ya hali ya msongamano mdogo wa macromolecular (Mchoro wa ziada wa 2c).Jukumu la eneo la C-terminal αS, lakini si urefu wake wote, katika mchakato wa LLPS ulionyeshwa kwa kuzuia uundaji wa matone kwa kutumia lahaja ya C-terminal iliyopunguzwa αS isiyo na mabaki 104-140 (Mchoro 1a) ya (ΔCt-) αS) protini (Kielelezo 2f na Kielelezo cha 2d cha Nyongeza).Ukoloni wa αS na ΔNt-Tau ulithibitishwa na hadubini ya fluorescence ya confocal (Mchoro wa ziada wa 1b).
Ili kujaribu zaidi utaratibu wa LLPS kati ya Tau441 na αS, lahaja ya ziada ya Tau ilitumiwa, ambayo ni kipande cha msingi wa filamenti ya helical (PHF) katika kikoa cha kuunganisha mikrotubu (MTBD), ambacho ikiwa kina vikoa vinne vya kurudia tabia, vinavyojulikana pia. kama kipande cha K18 (ona Mchoro 2e).Imeripotiwa hivi majuzi kuwa αS hufungamana kwa upendeleo kwa protini ya tau iliyoko katika kikoa chenye utajiri wa proline katika mlolongo unaotangulia kikoa cha kuunganisha mikrotubuli.Hata hivyo, eneo la PHF pia lina wingi wa masalia yaliyo na chaji chanya (ona Mchoro 2e), hasa lisini (mabaki 15%), ambayo ilitusukuma kupima kama eneo hili pia linachangia ufupishaji wa αS/Tau changamani.Tuliona kuwa K18 pekee haikuweza kusababisha LLPS katika viwango vya hadi 100 μM chini ya masharti yaliyojaribiwa (bafa ya LLPS yenye 15% PEG au 20% dextran) (Mchoro 2f).Hata hivyo, tulipoongeza 50 µM αS hadi 50 µM K18, uundaji wa haraka wa matone ya protini yenye K18 na αS ulizingatiwa na nephelometry (Mchoro wa ziada wa 2d) na microscopy ya WF (Mchoro 2f).Kama ilivyotarajiwa, ΔCt-αS haikuweza kurejesha tabia ya LLPS ya K18 (Mchoro 2f).Tunakumbuka kuwa mkusanyiko wa αS/K18 unahitaji viwango vya juu zaidi vya protini ili kushawishi LLPS ikilinganishwa na αS/ΔNt-Tau au αS/Tau441, vitu vingine kuwa sawa.Hii inawiana na mwingiliano wenye nguvu zaidi wa eneo la αS C-terminal na kikoa cha Tau chenye proline-tajiri ikilinganishwa na kikoa kinachofunga mikrotubuli, kama ilivyoelezwa hapo awali 31 .
Kwa kuzingatia kwamba ΔNt-Tau haiwezi kufanya LLPS bila αS, tulichagua lahaja hii ya Tau kama kielelezo cha kubainisha αS/Tau LLPS kutokana na usahili wake katika mifumo ya LLPS yenye Tau ya urefu kamili (isotype, Tau441/Tau441).yenye michakato changamano (heterotypic, αS/Tau441) ya mkusanyiko.Tulilinganisha kiwango cha mjumuisho wa αS (kama sehemu ya protini ya awamu iliyofupishwa, fαS,c) katika mifumo ya αS/Tau na αS/ΔNt-Tau kwa kupenyeza katikati na uchanganuzi wa awamu ya SDS-PAGE (ona 2e), tulipata maadili yanayofanana sana. kwa protini zote kwenye mkusanyiko sawa.Hasa, tulipata fαS,c 84 ± 2% na 79 ± 7% kwa αS/Tau na αS/ΔNt-Tau, mtawalia, na kupendekeza kwamba mwingiliano wa heterotypic kati ya αS na tau ni bora kuliko mwingiliano kati ya molekuli za tau.kati ya.
Mwingiliano na upolimishaji mbalimbali na athari za mchakato wa kufidia kwenye αS kinetiki zilichunguzwa kwa mara ya kwanza na urejeshaji wa umeme baada ya mbinu ya kupiga picha (FRAP).Tulijaribu αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau na αS/pLK coacervates (100 μM αS zikisaidiwa na 2 μM αS AF488-αS na 100 μM Tau441 au ΔNt-Tau au 1 mM pLK).Data ilipatikana ndani ya dakika 30 za kwanza baada ya kuchanganya vipengele vya sampuli.Kutoka kwa picha za mwakilishi za FRAP (Kielelezo 3a, αS / Tau441 condensation) na curves za kozi za wakati zinazofanana (Kielelezo 3b, Kielelezo cha ziada cha 3), inaweza kuonekana kuwa αS kinetics ni sawa na yale ya Tau441 coacervates.na ΔNt-Tau, ambayo ni haraka sana na pLK.Vigawo vya upanuzi vilivyokokotolewa vya αS ndani ya coacervate kulingana na FRAP (kama ilivyofafanuliwa na Kang na al. 35) ni D = 0.013 ± 0.009 µm2/s na D = 0.026 ± 0.008 µm2/s kwa αS-As/Tau ya Tau4 mfumo wa αS.pLK, Tau, na D = 0.18 ± 0.04 µm2 / s, kwa mtiririko huo (Mchoro 3c).Hata hivyo, mgawo wa usambaaji αS katika awamu ya kutawanywa ni maagizo kadhaa ya ukubwa wa juu kuliko awamu zote zilizofupishwa, kama inavyobainishwa na Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, angalia Kielelezo cha 3 cha Nyongeza) chini ya hali sawa (bafa ya LLPS) lakini kwa kukosekana kwa polycations. ( D = 8 ± 4 µm2/s).Kwa hivyo, kinetiki za tafsiri ya αS hupunguzwa kwa kiasi kikubwa katika coacervates ikilinganishwa na protini katika awamu iliyotawanywa kutokana na athari za msongamano wa molekuli, ingawa coacervates zote huhifadhi mali kama kioevu wakati wa nusu saa ya kwanza baada ya kuundwa kwao, tofauti na awamu ya tau.kasi kinetics katika pLK condensate.
a–c Uchanganuzi wa FRAP wa mienendo ya αS (2% AF488-iliyoandikwa αS) katika viambatisho vya kielektroniki.Picha wakilishi za majaribio ya αS/Tau441 FRAP katika nakala tatu huonyeshwa katika (a), ambapo miduara nyekundu huonyesha maeneo yaliyoondolewa rangi.Upau wa mizani ni 5 µm.b Wastani wa mikondo ya FRAP na (c) vihesabu vya uenezi vilivyokokotolewa (D) kwa matone 5–6 (N) tofauti kutoka kwa majaribio matatu kwa kutumia 100 µM αS na viwango sawa vya Tau441 (nyekundu) au ΔNt-Tau (bluu) au pLK (kijani) kwa mara kumi ya mkusanyiko wa LLPS.Mkengeuko wa kawaida wa curve ya FRAP unaonyeshwa kwa rangi iliyotiwa kivuli.Kwa ulinganisho, mgawo wa usambaaji αS katika awamu ya kutawanywa ulibainishwa katika nakala tatu kwa kutumia spektari ya uunganisho wa fluorescence (FCS) (angalia Kielelezo cha 3 cha Nyongeza na mbinu kwa maelezo zaidi).d Mwonekano unaoendelea wa X-band EPR wa 100 μM TEMPOL-122-αS katika bafa ya LLPS bila upatanishi wowote (nyeusi) au mbele ya 100 μM Tau441 (nyekundu) au ΔNt-Tau (bluu) au 1 mM pLK (kijani).Kipengele cha kuingiza kinaonyesha mwonekano uliokuzwa wa mistari thabiti ya uga ambapo mabadiliko makubwa zaidi hutokea.e Mikondo ya kufunga ya 50 μM TEMPOL-122-αS yenye upolimishaji mbalimbali kwa kukosekana kwa LLPS (hakuna PEG).Ukuaji uliopunguzwa wa bendi ya III ikilinganishwa na bendi ya II (IIII/III) ya wigo wa EPR uliorekebishwa unaonyeshwa kuongeza uwiano wa molar wa Tau441 (nyekundu), ΔNt-Tau (bluu) na pLK (kijani).Mistari yenye rangi huonyesha kufaa kwa data kwa kutumia muundo mbaya wa kuunganisha na n tovuti zinazofungamanisha zinazofanana na zinazojitegemea kwenye kila mshororo.Data ghafi hutolewa katika mfumo wa faili ghafi za data.
Kama kijalizo, tulichunguza mienendo ya αS katika viambatanisho mbalimbali kwa kutumia uwekaji alama wa spin ulioelekezwa (SDSL) na mwako wa paramagnetic wa elektroni (CW-EPR).Mbinu hii imethibitika kuwa muhimu sana katika kuripoti unyumbufu na mienendo ya IDP na azimio la kweli la mabaki36,37,38.Ili kufanya hivyo, tulitengeneza mabaki ya cysteine ​​katika vitambulisho vya Cys moja na tukatumia 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spin probe.Dawa zinazotokana na Maleimide huziweka lebo.Hasa zaidi, tuliingiza uchunguzi wa TEMPOL katika nafasi ya 122 au 24 αS (TEMPOL-122-αS na TEMPOL-24-αS).Katika kesi ya kwanza, tunalenga eneo la C-terminal ya protini, ambayo inahusika katika kuingiliana na polycations.Badala yake, nafasi ya 24 inaweza kutupa taarifa kuhusu mienendo ya jumla ya protini katika condensate.Katika visa vyote viwili, mawimbi ya EPR yaliyopatikana kwa protini za awamu iliyotawanywa yalilingana na itikadi kali za nitroksidi katika hali ya kusonga kwa kasi.Baada ya mgawanyiko wa awamu mbele ya tau au pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 au ΔNt-Tau kwa uwiano wa 1: 1 au pLK kwa uwiano wa 1:10), ongezeko la kiwango cha kilele cha jamaa kilizingatiwa katika wigo wa EPR wa αS.Mstari wa upotezaji ulipanuka, ikionyesha kupunguzwa kwa kinetics ya urekebishaji wa αS katika matone ikilinganishwa na protini katika awamu ya kuondokana (Kielelezo 3d, Kielelezo cha 4a).Mabadiliko haya yanajulikana zaidi katika nafasi ya 122. Wakati wa nafasi ya 24 uwepo wa pLK haukuathiri kinetics ya uchunguzi, katika nafasi ya 122 sura ya mstari wa spectral ilibadilika kwa kiasi kikubwa (Mchoro wa ziada wa 4a).Tulipojaribu kuiga mwonekano katika nafasi ya 122 kati ya mifumo miwili ya αS/polycation kwa kutumia muundo wa isotropiki (Mchoro wa Nyongeza 5a) unaotumiwa sana kuelezea mienendo ya IDP38,39 yenye lebo ya spin, hatukuweza kuunda upya mwonekano wa majaribio..Simulation Spectral ya nafasi ya 24 spins tofauti (Supplementary Mtini. 5a).Hii inapendekeza kuwa kuna nafasi za upendeleo katika nafasi ya usanidi wa mzunguko wa eneo la C-terminal ya αS kukiwa na aina nyingi.Wakati wa kuzingatia sehemu ya αS katika awamu iliyofupishwa chini ya hali ya majaribio ya EPR (84 ± 2%, 79 ± 7%, na 47 ± 4% kwa αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, na αS/pLK, mtawaliwa-tazama Nyongeza Kielelezo 2e cha uchanganuzi wa data c), inaweza kuonekana kuwa upanuzi unaogunduliwa na mbinu ya EPR unaonyesha mwingiliano wa eneo la C-terminal la αS na upolimishaji mbalimbali katika awamu iliyofupishwa (badiliko kuu wakati wa kutumia TEMPOL-122- αS), na sio uboreshaji wa protini.Kuongezeka kwa microviscosity huzingatiwa katika uchunguzi.Kama ilivyotarajiwa, wigo wa EPR wa protini chini ya hali nyingine isipokuwa LLPS ulirejeshwa kabisa wakati 1 M NaCl iliongezwa kwenye mchanganyiko (Mchoro wa Nyongeza 4b).Kwa ujumla, data yetu inapendekeza kuwa mabadiliko yaliyogunduliwa na CW-EPR hasa yanaonyesha mwingiliano wa eneo la C-terminal ya αS na upolimishaji mbalimbali katika awamu iliyofupishwa, na mwingiliano huu unaonekana kuwa na nguvu zaidi na pLK kuliko na Tau.
Ili kupata maelezo zaidi ya kimuundo kuhusu protini katika coacervate, tuliamua kujifunza mfumo wa LLPS kwa kutumia NMR katika suluhisho.Hata hivyo, tunaweza tu kugundua sehemu ya αS iliyobaki katika awamu ya kutawanywa, ambayo inaweza kuwa kutokana na kupungua kwa mienendo ya protini ndani ya coacervate na awamu mnene chini ya suluhisho katika uchanganuzi wa NMR.Tulipochanganua muundo na mienendo ya protini iliyosalia katika awamu ya kutawanywa ya sampuli ya LLPS kwa kutumia NMR (Mchoro wa Nyongeza 5c, d), tuligundua kuwa protini ilitenda kwa karibu kufanana mbele ya pLK na ΔNt-Tau, zote mbili. ambayo yalikuwa katika muundo wa pili na mienendo ya uti wa mgongo wa protini, iliyofunuliwa na majaribio ya mabadiliko ya pili ya kemikali na kupumzika kwa R1ρ.Data ya NMR inaonyesha kuwa C-terminus ya αS inakabiliwa na hasara kubwa ya kunyumbulika kwa upatanishi huku ikihifadhi asili yake isiyo na mpangilio, kama vile mlolongo mwingine wa protini, kutokana na mwingiliano wake na ukeketaji.
Kwa kuwa upanuzi wa mawimbi ya CW-EPR unaozingatiwa katika awamu iliyofupishwa ya TEMPOL-122-αS huakisi mwingiliano wa protini na ukeketaji, tulifanya uwekaji alama wa EPR ili kutathmini mshikamano unaofungamana wa αS kwa upolimishaji mbalimbali bila kuwepo kwa LLPS (hakuna mkusanyiko wa Buffer LLPS), ikipendekeza kwamba mwingiliano ni sawa katika awamu za kuzimua na kujilimbikizia (ambayo inathibitishwa na data yetu, Kielelezo cha 4a cha Nyongeza na Kielelezo cha 6 cha Nyongeza).Lengo lilikuwa kuona ikiwa viambatanisho vyote, licha ya sifa zao za kawaida zinazofanana na giligili, vinaonyesha tabia yoyote ya msingi ya kutofautisha katika kiwango cha molekuli.Kama ilivyotarajiwa, wigo wa EPR ulipanuka kwa kuongezeka kwa ukolezi wa polication, ikionyesha kupungua kwa kunyumbulika kwa Masi kutokana na mwingiliano wa molekuli ya washirika wote wa mwingiliano karibu na kueneza (Mchoro 3e, Kielelezo cha 6 cha Nyongeza).pLK ilipata kueneza huku kwa uwiano wa chini wa molar (polycation:αS) ikilinganishwa na ΔNt-Tau na Tau441.Kwa hakika, ulinganisho wa data na kielelezo cha takriban cha kumfunga kwa kuchukulia n tovuti zinazofanana na zinazojitegemea zilionyesha kuwa utengano wa mara kwa mara wa pLK (~5 μM) ni mpangilio wa chini zaidi kuliko ule wa Tau441 au ΔNt-Tau (~50 μM. )µM).Ingawa hii ni makadirio mabaya, hii inapendekeza kwamba αS ina uhusiano wa juu zaidi kwa upolimishaji rahisi na maeneo ya chaji yanayoendelea.Kwa kuzingatia tofauti hii ya mshikamano kati ya αS na aina mbalimbali za upolimishaji, tulidhania kuwa sifa zao za kioevu zinaweza kubadilika tofauti baada ya muda na hivyo kuteseka kutokana na michakato tofauti ya LSPT.
Kwa kuzingatia mazingira yaliyojaa sana ndani ya protini coacervate na asili ya amiloidi ya protini, tuliona tabia ya coacervate baada ya muda kugundua michakato iwezekanayo ya LSPT.Kwa kutumia hadubini ya BF na CF (Mchoro 4), tuliona kwamba αS/Tau441 inashikamana kwa kiwango kikubwa katika mmumunyo, na kutengeneza matone makubwa ambayo yanagusana na kuloweka uso chini ya kisima/slaidi kama matone yaliyojaa, kama inavyotarajiwa (Mtini wa Nyongeza. . 7d);tunaita miundo hii ya chini "rafu za protini".Miundo hii ilibaki kuwa maji kwani ilibakiza uwezo wa kuunganisha (Mchoro wa Nyongeza 7b) na inaweza kuonekana kwa saa kadhaa baada ya LLPS kuanzishwa (Mchoro 4 na Mchoro wa Nyongeza 7c).Tuliona kuwa mchakato wa uloweshaji unyevu unapendelewa kwenye uso wa haidrofili badala ya nyenzo za haidrofobu (Mchoro wa Nyongeza 7a), kama inavyotarajiwa kwa viambatisho vya kielektroniki vyenye chaji zisizosawazisha na hivyo uwezekano wa juu wa uso wa kielektroniki.Hasa, αS/ΔNt-Tau coalescence na Rafting walikuwa kwa kiasi kikubwa, wakati αS/pLK condensates walikuwa kwa kiasi kikubwa kupunguzwa (Mtini. 4).Wakati wa muda mfupi wa incubation, matone ya αS/pLK yaliweza kuunganisha na mvua uso wa hidrofili, lakini mchakato huu ulisimama haraka na baada ya masaa 5 ya incubation, matukio machache tu ya ushirikiano na hakuna wetting iliyozingatiwa.- mpito wa gel-drip.
Mwakilishi wa BF (paneli za greyscale) na CF (paneli za kulia, AF488-iliyoandikwa αS katika kijani kibichi) ya sampuli za coacervate zenye 100 µM αS (lebo ya fluorescent) katika bafa ya LLPS kukiwa na 100 µM Tau441nce Δ 100 µM Tau441 (juu) picha za fluorescent -Tau (katikati) au 1 mM pLK (chini) kwa nyakati tofauti za incubation na urefu wa kuzingatia (z, umbali kutoka chini ya sahani vizuri).Majaribio yalirudiwa mara 4-6 bila kujitegemea na matokeo sawa.αS/Tau441 coacervates huwa na mvua baada ya saa 24, na kutengeneza rafu kubwa kuliko picha.Upau wa mizani wa picha zote ni 20 µm.
Kisha tuliuliza ikiwa vidimbwi vikubwa vya protini vinavyofanana na umajimaji vilivyoundwa katika αS/Tau441 LLPS vinaweza kusababisha muunganisho wa amiloidi wa protini zozote zilizochunguzwa.Tulifuata ukomavu wa matone αS/Tau441 baada ya muda kwa hadubini ya WF chini ya hali sawa na hapo juu, lakini kwa kutumia 1 μM AF488-iliyoandikwa αS na Atto647N-iliyoandikwa Tau441 (Mchoro 5a).Kama ilivyotarajiwa, tuliona ujanibishaji kamili wa protini katika mchakato mzima wa kukomaa.Inashangaza, kutoka kwa ca.Baada ya masaa 5, miundo yenye nguvu zaidi isiyo ya mviringo ilizingatiwa ndani ya rafts, ambayo tuliita "pointi", baadhi ya ambayo ilikuwa colocalized na αS, na baadhi walikuwa utajiri katika Tau441 (Mchoro 5a, mishale nyeupe).Matangazo haya yamezingatiwa kila wakati ndani ya rafu kwa kiwango kikubwa zaidi kwa αS/ΔNt-Tau kuliko αS/ΔNt-Tau.Hakukuwa na madoa tofauti katika matone ya mifumo ya pLK na Tau isiyo na uwezo wa kuunganisha/kulowesha.Ili kupima kama madoa haya yaliyo na αS na Tau441 ni mkusanyiko unaofanana na amiloidi, tulifanya jaribio kama hilo kwa kutumia hadubini ya CF ambapo Tau441 iliwekwa lebo ya Atto647N na 12.5 μM thioflavin-T maalum ya amyloid (ThT) iliongezwa tangu mwanzo.rangi.Ingawa ThT-madoa ya αS/Tau441 matone au rafts haikuzingatiwa hata baada ya h 24 ya incubation (Mchoro 5b, safu ya juu-matone yaliyobaki juu ya rafu za protini), miundo ya ThT-chanya iliyo na Atto647N-Tau441 ndani ya rafts ilikuwa dhaifu sana.hii huiga saizi, umbo, na eneo la madoa yaliyoelezwa hapo awali (Mtini. 5b, safu mlalo za kati na za chini), ikipendekeza kwamba madoa yanaweza kuendana na mijumuisho ya amiloidi inayoundwa katika viambatisho vya viowevu vya kuzeeka.
WF 25 μM αS katika nyakati mbalimbali za incubation na urefu focal (z, umbali kutoka chini isiyofungwa) mbele ya 25 μM Tau441 (1 μM AF488-iliyoandikwa αS na Atto647N-iliyoandikwa Tau441) kwenye kisima cha bati ya hadubini yenye bafa ya LLPS) .Majaribio sita yalirudiwa kwa kujitegemea na matokeo sawa.b picha ya hadubini ya CF ya 25 μM αS mbele ya 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-iliyoandikwa Tau441) na 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Matone ya protini yenye uzani na rafu za protini zilizowekwa na madoa huonyeshwa kwenye safu za juu na za kati, mtawalia.Safu ya chini inaonyesha picha za rafu na matone kutoka kwa nakala 3 zinazojitegemea.Mishale nyeupe inaonyesha nukta chanya za ThT katika paneli zote mbili.Upau wa mizani wa picha zote ni 20 µm.
Ili kuchunguza kwa undani zaidi mabadiliko katika mtandao wa protini ya coacervate wakati wa mpito kutoka kioevu hadi imara, tulitumia picha ya maisha ya fluorescence (FLIM) na Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (Mchoro 6 na Supplementary Figures 8 na 9).Tulikisia kuwa upevushaji mshikamano wa safu kuwa muundo wa protini uliofupishwa zaidi au hata kama dhabiti huleta mgusano wa karibu kati ya protini na kichunguzi cha umeme kilichoambatishwa kwayo, na uwezekano wa kutoa athari ya kuzima inayoonyeshwa katika muda mfupi wa maisha ya uchunguzi ( τ ) , kama ilivyoelezwa hapo awali40.,41 ,42.Kwa kuongezea, kwa sampuli zilizo na lebo mbili (AF488 na Atto647N kama dyes za wafadhili na wakubali wa FRET, mtawalia), kupungua huku kwa τ kunaweza pia kuambatana na ufupishaji wa coacervate na kuongezeka kwa ufanisi wa FRET(E) wakati wa LSPT.Tulifuatilia uundaji wa raft na doa kwa muda katika sampuli za LLPS αS/Tau441 na αS/ΔNt-Tau (25 µM za kila protini katika bafa ya LLPS iliyo na 1 µM AF488 iliyoandikwa αS na/au Atto647N inayoitwa Tau441 au ΔNt-Tau).Tuliona mwelekeo wa jumla kwa kuwa muda wa maisha ya umeme wa vichunguzi vya AF488 (τ488) na Atto647N (τ647N) ulipungua kidogo kadiri viambatisho vinavyoendelea kukomaa (Mchoro 6 na Kielelezo cha 8c cha Nyongeza).Jambo la kufurahisha, badiliko hili liliimarishwa kwa kiasi kikubwa kwa nukta zilizo ndani ya rafu (Mchoro 6c), ikionyesha kwamba ufupishaji zaidi wa protini ulitokea kwenye vitone.Katika kuunga mkono hili, hakuna mabadiliko makubwa katika maisha ya fluorescence yaliyozingatiwa kwa matone ya αS/ΔNt-Tau yaliyo na umri wa h 24 (Mchoro wa 8d wa Nyongeza), ikionyesha kuwa uchanganyaji wa matone ni mchakato tofauti na uonekanaji na hauambatani na upangaji upya wa molekuli. ndani ya coacervates.Ikumbukwe kwamba dots zina ukubwa tofauti na maudhui ya kutofautiana katika αS, hasa kwa mfumo wa αS/Tau441 (Mchoro wa ziada wa 8e).Kupungua kwa muda wa maisha ya fluorescence kuliambatana na ongezeko la nguvu, hasa kwa Atto647N iliyoitwa Tau441 (Mchoro wa Nyongeza 8a), na ufanisi wa juu wa FRET kwa mifumo ya αS/Tau441 na αS/ΔNt-Tau, ikionyesha ufupishaji zaidi katika LLPS saa tano. baada ya kuchochea, protini ndani ya umeme tuli hupunguzwa.Ikilinganishwa na αS/ΔNt-Tau, tuliona viwango vya chini vya τ647N na viwango vya juu zaidi τ488 katika madoa αS/Tau441, yakiambatana na thamani za chini na zisizo sawa za FRET.Inawezekana, hii inaweza kuhusishwa na ukweli kwamba katika mfumo wa αS/Tau441, wingi wa αS unaozingatiwa na unaotarajiwa katika mkusanyiko ni tofauti zaidi, mara nyingi substoichiometric ikilinganishwa na Tau, kwa kuwa Tau441 yenyewe inaweza pia kupitia LLPS na mkusanyiko (Mchoro wa Nyongeza 8e) .Hata hivyo, kiwango cha mshikamano wa matone, uundaji wa rafter, na, muhimu zaidi, mkusanyiko wa protini ndani ya coacervates ya kioevu-kama ni ya juu wakati Tau441 na αS zote zipo.
picha za darubini ya maisha (FLIM) ya αS/Tau441 na αS/ΔNt-Tau yenye 25 μM ya kila protini (1 μM AF488 yenye lebo αS na 1 μM Atto647N-iliyoandikwa Tau441 au ΔNt-Tau) katika bafa ya LLPS.Safu wima zinaonyesha picha wakilishi za sampuli za LLPS katika nyakati tofauti za kukomaa (dakika 30, saa 5 na saa 24).Fremu nyekundu inaonyesha eneo lililo na madoa αS/Tau441.Muda wa maisha huonyeshwa kama pau za rangi.Upau wa kipimo = 20 µm kwa picha zote.b Picha ya FLIM iliyokuzwa ya eneo lililochaguliwa, iliyoonyeshwa kwenye kisanduku chekundu kwenye paneli a.Masafa ya maisha yanaonyeshwa kwa kutumia mizani ya rangi sawa na kwenye paneli a.Upau wa mizani = 5 µm.c Histogramu zinazoonyesha AF488 (zilizoambatishwa kwa αS) au Atto647N (zilizoambatanishwa na Tau) kwa spishi tofauti za protini (matone-D-, raft-R- na madoadoa-P) zilizotambuliwa katika picha za FLIM zilizorekodiwa kwa αS-) muda wa usambazaji wa muda wa Tau441 na Sampuli za αS/ΔNt-Tau coacervate (N = 17-32 ROI kwa D, 29-44 ROI kwa R, na 21-51 ROI kwa pointi).Thamani za wastani na za wastani zinaonyeshwa kama miraba ya manjano na mistari nyeusi ndani ya visanduku, mtawalia.Mipaka ya chini na ya juu ya kisanduku inawakilisha quartiles ya kwanza na ya tatu, mtawaliwa, na maadili ya chini na ya juu ndani ya safu ya mara 1.5 ya interquartile (IQR) huonyeshwa kama whiskers.Nje huonyeshwa kama almasi nyeusi.Umuhimu wa takwimu kati ya jozi za usambazaji ulibainishwa kwa kutumia sampuli mbili za jaribio la t, ikizingatiwa tofauti zisizo sawa.Thamani za p za mtihani wa mikia miwili huonyeshwa kwa nyota kwa kila jozi ya data iliyolinganishwa (* thamani ya p > 0.01, ** p-thamani > 0.001, *** p-thamani > 0.0001, **** p-thamani > 0.00001), ns Huonyesha kutojali (thamani ya p > 0.05).Thamani halisi za p zimetolewa katika Jedwali la 1 la Nyongeza, na data asilia inawasilishwa kama faili mbichi za data.
Ili kuonyesha zaidi asili ya amiloidi-kama ya madoadoa/jumla, tulitibu sampuli za coacervate zisizo na doa kwa saa 24 na viwango vya juu vya (1 M) NaCl, ambayo ilisababisha kutenganishwa kwa mkusanyiko kutoka kwa protini coacervates.Wakati mijumuisho iliyotengwa (yaani, myeyusho uliotawanywa wa mijumuiko) ilipozingatiwa kwa kutumia hadubini ya nguvu ya atomiki (AFM), tuliona mofolojia yenye umbo la duara yenye urefu wa kawaida wa takriban nm 15, ambayo huelekea kuhusishwa chini ya hali ya mkusanyiko wa chumvi nyingi, sawa na tabia ya nyuzi za amiloidi za kawaida kutokana na athari kali ya haidrofobu kwenye uso (kumbuka kuwa nyuzi huwa na urefu wa ~ 10 nm) (Mchoro wa Nyongeza 10a).Inashangaza, wakati hesabu zilizotengwa ziliwekwa pamoja na ThT katika kipimo cha kawaida cha fluorescence cha ThT, tuliona ongezeko kubwa la kiasi cha mazao ya fluorescence ya ThT, ikilinganishwa na ile iliyozingatiwa wakati rangi iliingizwa na nyuzi za amyloid za kawaida za αS (Kielelezo cha Nyongeza. mijumuisho ya coacervate ina miundo kama amiloidi..Kwa hakika, mijumuisho ilistahimili viwango vya juu vya chumvi lakini ni nyeti kwa kloridi ya guanidine ya 4 M (GdnHCl), kama vile nyuzi za amiloidi (Mchoro wa Nyongeza 10c).
Kisha, tulichanganua muundo wa mijumuisho kwa kutumia fluorescence ya molekuli moja, uunganisho mahususi wa uunganisho wa florescence/spektra ya uunganisho mtambuka (FCS/FCCS), na uchanganuzi mpasuko wa ugunduzi wa matukio ya rangi mbili (TCCD).Kufikia hili, tulitenga hesabu zilizoundwa baada ya saa 24 za kuangukiwa katika sampuli 100 za LLPS zilizo na αS na Tau441 (zote 25 μM) pamoja na 1 μM AF488-iliyoandikwa αS na 1 μM Atto647N iliyoandikwa Tau441.Punguza suluhisho la jumla lililotawanywa kwa hali ya monomolekuli kwa kutumia bafa ile ile isiyo na PEG na 1 M NaCl (bafa sawa inayotumika kutenganisha mikusanyiko kutoka kwa coacervate) ili kuzuia mwingiliano wowote wa kielektroniki kati ya LLPS na protini.Mfano wa trajectory ya wakati wa molekuli moja inaweza kuonekana kwenye Mchoro 7a.Uchanganuzi wa FCCS/FCS (uhusiano mtambuka, CC na uunganisho otomatiki, AC) ulionyesha kuwa majumuisho yenye αS na tau yalikuwa mengi katika sampuli (ona mkunjo wa CC kwenye Mchoro 7b, paneli ya kushoto), na ziada ya mabaki ya protini ya monomeri ilizuka kama matokeo ya mchakato wa dilution (ona AC curves katika Mchoro 7b, paneli kushoto).Majaribio ya kudhibiti yaliyofanywa chini ya hali sawa za utatuzi kwa kutumia sampuli zilizo na protini za monomeriki pekee hazikuonyesha mikondo ya CC, na mikunjo ya AC inalingana vyema na muundo wa kipengee kimoja cha usambaaji (Eq. 4), ambapo protini za monomeriki huwa na migawo ya usambaaji inayotarajiwa (Mchoro 7b. ), paneli ya kulia).Mgawo wa usambaaji wa chembe zilizojumlishwa ni chini ya 1 µm2/s, na ule wa protini za monomeriki ni takriban 1 µm2/s.50–100 µm/s;thamani ni sawa na thamani zilizochapishwa hapo awali za sonicated αS amyloid fibrils na monomeri αS tofauti chini ya hali sawa za ufumbuzi44.Tulipochanganua majumuisho kwa uchanganuzi wa mlipuko wa TCCD (Kielelezo 7c, paneli ya juu), tuligundua kuwa katika kila mkusanyiko uliotengwa (αS/Tau heteroaggregate), takriban 60% ya jumla zilizogunduliwa zilikuwa na αS na tau, takriban 30% zilizomo pekee. tau, takriban 10% αS pekee.Uchanganuzi wa stoichiometric wa αS/Tau heteroaggregates ulionyesha kuwa sehemu kubwa ya heteroaggregate zilirutubishwa katika tau (stoichiometry chini ya 0.5, wastani wa idadi ya molekuli za tau kwa kila mkusanyiko ni mara 4 zaidi ya molekuli αS), ambayo inaendana na kazi yetu inayozingatiwa katika FLIM in situ. majaribio..Uchambuzi wa FRET ulionyesha kuwa hesabu hizi zilikuwa na protini zote mbili, ingawa maadili halisi ya FRET katika kesi hii sio muhimu sana, kwani usambazaji wa fluorophores katika kila jumla ulikuwa wa nasibu kwa sababu ya ziada ya protini isiyo na lebo iliyotumiwa katika jaribio.Cha kufurahisha, tulipofanya uchanganuzi uleule kwa kutumia lahaja ya Tau yenye upungufu wa amiloidi 45,46 (ona Kielelezo cha Nyongeza 11a,b), tuligundua kuwa ingawa mkusanyiko wa αS wa kielektroniki ulikuwa sawa (Mchoro wa Nyongeza. 11c, d), uwezo wa kuunda aggregate ndani ya coacervate ulipunguzwa kwa kiasi kikubwa na FLIM iligundua matangazo kadhaa katika majaribio ya situ, na mikondo dhaifu ya uunganisho mtambuka ilizingatiwa kwa sampuli za jumla zilizotengwa.Hata hivyo, kwa idadi ndogo ya mijumuisho iliyogunduliwa (moja tu ya kumi ya Tau441), tuliona kwamba kila mkusanyiko ulirutubishwa katika αS kuliko lahaja hii ya Tau, ikiwa na takriban 50% ya mijumuisho iliyogunduliwa iliyo na molekuli za αS pekee, na αS ilikuwa tofauti kupita kiasi. .aggregates (angalia Supplementary Mtini. 11e), tofauti na aggregates heterogeneous yanayotokana na Tau441 (Mtini. 6f).Matokeo ya majaribio haya yalionyesha kuwa ingawa αS yenyewe ina uwezo wa kukusanyika pamoja na tau ndani ya coacervate, nukleo ya tau inafaa zaidi chini ya hali hizi, na mijumuisho inayofanana na amiloidi inaweza kutenda kama aina ya αS na tau.Hata hivyo, mara tu msingi wa tau-tajiri unapoundwa, mwingiliano tofauti kati ya αS na tau hupendelewa katika mijumuisho juu ya mwingiliano wa homotipiki kati ya molekuli za tau;pia tunachunguza mitandao ya protini katika αS/tau coacervates kioevu.
Mwakilisho wa athari za muda za fluorescence ya molekuli moja ya mkusanyiko uliotengwa iliyoundwa katika αS/Tau441 viambatisho vya kielektroniki.Milipuko inayolingana na coaggregates αS/Tau441 (mipasuko juu ya kizingiti kilichoonyeshwa) ilizingatiwa katika njia tatu za kugundua (AF488 na Atto647N chafu baada ya msisimko wa moja kwa moja, mistari ya bluu na nyekundu, utoaji wa Atto647N baada ya msisimko usio wa moja kwa moja), FRET, mstari wa urujuani).b Uchambuzi wa FCS/FCCS wa sampuli ya majumuisho ya αS/Tau441 yaliyotengwa yaliyopatikana kutoka kwa LLPS (jopo la kushoto).Mikondo ya Uunganisho Kiotomatiki (AC) ya AF488 na Atto647N huonyeshwa kwa rangi ya samawati na nyekundu, mtawalia, na mikunjo ya uwiano mtambuka (CC) inayohusishwa na mkusanyiko ulio na rangi zote mbili huonyeshwa kwa rangi ya zambarau.Mikondo ya AC huakisi uwepo wa spishi za protini zilizo na lebo moja na zilizojumlishwa, ilhali miindo ya CC inaonyesha tu mgawanyiko wa mijumuisho yenye lebo mbili.Uchanganuzi sawa, lakini chini ya hali sawa za utatuzi kama katika maeneo yaliyotengwa, sampuli zilizo na αS na Tau441 pekee huonyeshwa kama vidhibiti katika paneli ya kulia.c Uchanganuzi wa mwako wa Fluorescence wa molekuli moja ya mkusanyiko uliotengwa iliyoundwa katika viambatisho vya kielektroniki vya αS/Tau441.Taarifa kwa kila mkusanyiko unaopatikana katika marudio manne tofauti (N = 152) yamepangwa dhidi ya stoichiometry, thamani za S, na ufanisi wa FRET (paneli ya juu, upau wa rangi huonyesha tukio).Aina tatu za mijumlisho zinaweza kutofautishwa: -aS-tu mijumlisho yenye S~1 na FRET~0, mijumlisho ya Tau-tu yenye S~0 na FRET~1, na mijumlisho mingi ya Tau/αS yenye makadirio ya kati ya S na FRET ya kiasi hicho. ya alama za protini zote mbili zilizogunduliwa katika kila mkusanyiko wa aina tofauti (N = 100) zinaonyeshwa kwenye paneli ya chini (kipimo cha rangi kinaonyesha tukio).Data ghafi hutolewa katika mfumo wa faili ghafi za data.
Kukomaa au kuzeeka kwa protini ya kioevu huganda katika muundo kama gel au muundo dhabiti baada ya muda kumeripotiwa kuhusika katika kazi kadhaa za kisaikolojia za condensate47 na pia katika ugonjwa, kama mchakato usio wa kawaida unaotangulia mkusanyiko wa amiloidi 7, 48, 49. Hapa tunasoma utengano wa awamu na tabia kwa undani.LSPT αS katika uwepo wa upolimishaji nasibu katika mazingira yanayodhibitiwa katika viwango vya chini vya mikromolari na hali husika za kisaikolojia (kumbuka kuwa ukolezi uliokokotolewa wa kisaikolojia wa αS ni >1 µM50), kufuatia tabia ya kawaida inayoendeshwa na thermodynamically ya LPS.Tuligundua kuwa αS, ambayo ina eneo la C-terminal yenye chaji hasi sana katika pH ya kisaikolojia, inaweza kutengeneza matone yenye utajiri wa protini katika mmumunyo wa maji kupitia LLPS kukiwa na peptidi zilizoharibika sana kama vile pLK au Tau kupitia mchakato wa kielektroniki. condensation tata mbele ya macromolecules aggregation.Mchakato huu unaweza kuwa na athari zinazofaa katika mazingira ya seli ambapo αS hukutana na molekuli mbalimbali za polikanoiki zinazohusiana na mkusanyiko wake unaohusishwa na ugonjwa katika vitro na vivo51,52,53,54.
Katika tafiti nyingi, mienendo ya protini ndani ya matone imezingatiwa kuwa mojawapo ya vipengele muhimu vinavyoamua mchakato wa kukomaa55,56.Katika viambatisho vya αS vya kielektroniki na upokeno, mchakato wa kukomaa kwa hakika unategemea nguvu ya mwingiliano na uketo, valence, na wingi wa mwingiliano huu.Nadharia ya usawa inapendekeza kwamba mazingira ya usawa ya majimbo mawili ya maji yanaweza kuwa kuwepo kwa tone kubwa lenye wingi wa biopolima zinazoendesha LLPS57,58.Ukuaji wa matone unaweza kupatikana kwa kukomaa kwa Ostwald59, coalescence60 au matumizi ya monoma ya bure katika awamu iliyotawanywa61.Kwa αS na Tau441, ΔNt-Tau au pLK, protini nyingi zilijilimbikizia kwenye condensate chini ya masharti yaliyotumika katika utafiti huu.Hata hivyo, wakati matone ya tau yenye ukubwa kamili yaliungana kwa haraka wakati wa kulowesha usoni, kushikana kwa matone na kulowesha kulikuwa vigumu kwa ΔNt-Tau na pLK, na kupendekeza upotevu wa haraka wa sifa za kioevu katika mifumo hii miwili.Kulingana na uchanganuzi wetu wa FLIM-FRET, matone ya zamani ya pLK na ΔNt-Tau yalionyesha kiwango sawa cha mkusanyiko wa protini (maisha sawa ya fluorescence) kama matone asili, na kupendekeza kuwa mtandao asili wa protini ulihifadhiwa, ingawa ngumu zaidi.
Tunasawazisha matokeo yetu ya majaribio katika muundo ufuatao (Mchoro 8).Matone yaliyoundwa kwa muda mara nyingi ni mitandao ya protini bila fidia ya kielektroniki, na kwa hivyo kuna maeneo ya usawa wa malipo, haswa kwenye kiolesura cha matone, na kusababisha matone yenye uwezo mkubwa wa uso wa kielektroniki.Ili kufidia malipo (jambo linalojulikana kama upungufu wa valence) na kupunguza uwezekano wa uso wa matone, matone yanaweza kujumuisha polipeptidi mpya kutoka kwa awamu ya kuzimua, kupanga upya mitandao ya protini ili kuboresha mwingiliano wa malipo ya chaji, na kuingiliana na matone mengine.na nyuso (wetting).Matone ya αS/pLK, kutokana na mtandao wao wa protini rahisi (mwingiliano tu wa heterotypic kati ya αS na pLK) na mshikamano mkubwa zaidi wa mwingiliano wa protini-protini, inaonekana kuwa na uwezo wa kusawazisha malipo ya condensate kwa haraka zaidi;kwa hakika, tuliona kinetiki za protini za kasi zaidi katika viambatisho vya αS/pLK vilivyoundwa awali kuliko katika αS/Tau.Baada ya kupungua kwa valence, mwingiliano huwa chini ya ephemeral na matone hupoteza sifa zao za kioevu na kugeuka kuwa matone ya gel, yasiyo ya kuwaka yenye uwezo mdogo wa uso wa umeme (na kwa hiyo haiwezi kulowesha uso).Kinyume chake, vitone vya αS/Tau havina ufanisi katika kuboresha mizani ya malipo ya matone kutokana na mitandao changamano ya protini (yenye mwingiliano wa homotypic na heterotypic) na asili dhaifu ya mwingiliano wa protini.Hii inasababisha matone ambayo huhifadhi tabia ya kimiminika kwa muda mrefu na kuonyesha uwezo wa juu wa uso wa kielektroniki ambao huelekea kupunguzwa kwa kushikana na kukua (hivyo kupunguza uwiano wa eneo/kiasi cha matone) na kwa kulowesha chem ya uso haidrofili.Hii huunda maktaba kubwa za protini zilizokolezwa ambazo huhifadhi sifa za umajimaji kwani mwingiliano husalia kuwa wa muda mfupi kutokana na utafutaji wa mara kwa mara wa uboreshaji wa malipo katika mtandao wa protini.Jambo la kufurahisha ni kwamba aina za Tau zilizopunguzwa kwa muda wa N, ikijumuisha baadhi ya isoform62 zinazotokea kiasili, zinaonyesha tabia ya wastani, huku baadhi ya vitu vinavyochangia kuzeeka na αS kuwa matone yanayofanana na jeli ya muda mrefu, huku mengine yakibadilika na kuwa vimiminiko vikubwa vya kioevu.Uwili huu katika upevushaji wa viambatisho vya kielektroniki vya αS unalingana na tafiti za hivi majuzi za kinadharia na majaribio za LLPS ambazo zimebainisha uwiano kati ya kupungua kwa valence na sieving ya kielektroniki katika condensate kama ufunguo wa kudhibiti ukubwa wa condensate na sifa za umajimaji.Utaratibu 58.61.
Mpango huu unaonyesha njia ya kuunganisha ya amiloidi ya αS na Tau441 kupitia LLPS na LSPT.Pamoja na kanda za ziada zenye anioni (nyekundu) na tajiri wa cation (bluu), αS na tau tuamo ya umeme ya tau yenye valence ya kuridhisha ina nishati ya chini ya uso na hivyo kuungana kidogo, na kusababisha kuzeeka kwa haraka kwa matone.Hali ya gel isiyo ya agglomerated imara inapatikana..Hali hii ni nzuri sana katika kesi ya mfumo wa αS/pLK kutokana na mshikamano wake wa juu na mtandao rahisi wa mwingiliano wa protini-jozi, ambayo inaruhusu mpito wa haraka wa gel.Kinyume chake, matone yenye valence isiyoridhisha na, kwa hiyo, mikoa yenye malipo ya protini inapatikana kwa mwingiliano, hufanya iwe rahisi kwa coacervate kuunganisha na kulowesha uso wa hydrophilic ili kupunguza nishati yake ya juu ya uso.Hali hii inafaa zaidi kwa αS/Tau441 coacervates, ambazo zina mtandao tata wa aina nyingi unaojumuisha mwingiliano dhaifu wa Tau-Tau na αS-Tau.Kwa upande mwingine, coacervates kubwa zaidi itahifadhi kwa urahisi sifa zao kama maji, na kuruhusu mwingiliano mwingine wa protini-kwa-protini kutokea.Hatimaye, mijumuisho ya amiloidi tofauti iliyo na αS na tau huunda ndani ya giligili ya coacervate, ambayo inaweza kuhusishwa na ile inayopatikana katika miili ya mjumuisho, ambayo ni alama mahususi za magonjwa ya mfumo wa neva.
Miundo mikubwa inayofanana na giligili iliyoundwa wakati wa kukomaa kwa αS/Tau441 ikiwa na mazingira ya protini yenye msongamano mkubwa lakini yenye nguvu na, kwa kiasi kidogo, viunganishi vya αS/ΔNt-Tau ni hifadhi bora za ujumuishaji wa mkusanyiko wa protini.Hakika tumeona uundaji wa miunganisho ya protini dhabiti katika aina hii ya viambata vya protini, mara nyingi huwa na αS na tau.Tumeonyesha kuwa miunganisho hii ya kiheteroidi imeimarishwa kwa mwingiliano usio wa umeme, inaweza kuunganisha rangi maalum za amiloidi za ThT kwa njia sawa na nyuzi za amiloidi za kawaida, na kwa kweli zina ukinzani sawa na athari mbalimbali.Jumla ya αS/tau iliyoundwa na LLPS ilionyeshwa kuwa na sifa zinazofanana na amiloidi.Kwa hakika, lahaja iliyokomaa ya Tau yenye upungufu katika muunganisho wa amiloidi imeharibika kwa kiasi kikubwa katika uundaji wa mijumuisho hii ya αS isiyo ya kawaida ndani ya coacervate ya kielektroniki ya kielektroniki.Uundaji wa mkusanyiko wa αS/Tau441 ulizingatiwa tu ndani ya coacervates, ambayo ilihifadhi mali-kama kioevu, na kamwe, ikiwa coacervates / droplets haikufikia hali ya gel.Katika kesi ya mwisho, nguvu iliyoongezeka ya mwingiliano wa kielektroniki na, kwa sababu hiyo, uthabiti wa mtandao wa protini huzuia upangaji upya unaohitajika wa protini ili kuanzisha mwingiliano mpya wa protini muhimu kwa nuklea ya amiloidi.Hata hivyo, hii inaweza kufikiwa katika viambatisho vinavyonyumbulika zaidi, vinavyofanana na kioevu, ambavyo kwa upande wake vina uwezekano mkubwa wa kubaki kioevu vinapoongezeka ukubwa.
Ukweli kwamba uundaji wa mijumuisho ndani ya awamu iliyofupishwa ni afadhali katika ufupishaji mkubwa wa αS/Tau kuliko katika matone madogo ambayo yanaungana kwa haraka, unaonyesha umuhimu wa kutambua vipengele vinavyodhibiti mshikamano wa matone.Kwa hivyo, sio tu tabia ya kutenganisha awamu, lakini ukubwa wa condensate lazima kudhibitiwa kwa utendaji mzuri pamoja na kuzuia magonjwa58,61.Matokeo yetu pia yanaonyesha umuhimu wa usawa kati ya LLPS na LSPT kwa mfumo wa αS/Tau.Ingawa uundaji wa matone unaweza kulinda dhidi ya mkusanyiko wa amiloidi kwa kupunguza kiasi cha monoma za protini zinazopatikana chini ya hali ya kueneza, kama ilivyopendekezwa katika mifumo mingine63,64, muunganisho wa matone katika viwango vya juu vya matone kunaweza kusababisha mkusanyiko wa protini wa ndani kupitia upangaji upya wa upatanisho polepole.mitandao ya protini..
Kwa ujumla, data yetu inasisitiza kwa dhati umuhimu wa valence shirikishi na mwingiliano wa kuridhika/kutoridhika katika mitandao ya kushuka katika muktadha wa LSPT.Hasa, tunaonyesha kwamba bisibisi za urefu kamili za αS/Tau441 zinaweza kuunganisha na kutengeneza viini vya amyloid-kama vile heteroaggregate zinazojumuisha protini zote mbili na kupendekeza utaratibu wa molekuli kulingana na matokeo yetu ya majaribio.Ujumuishaji wa protini mbili katika kiowevu cha αS/Tau tunachoripoti hapa unaweza kuwa unahusiana na ujanibishaji-shirikishi wa protini mbili katika mjumuisho, ambazo ni alama kuu za ugonjwa, na unaweza kuchangia kuelewa uhusiano kati ya LLPS na muunganisho wa amiloidi, kutengeneza njia kwa ajili ya IDP yenye chaji nyingi katika kuzorota kwa mfumo wa neva.
Monomeric WT-αS, cysteine ​​​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) na lahaja za ΔCt-αS (Δ101-140) zilionyeshwa katika E. koli na kusafishwa kama ilivyoelezwa hapo awali.5 mM DTT ilijumuishwa katika hatua zote za utakaso wa αS cysteine ​​​​mutants ili kuzuia uundaji wa dhamana ya disulfide.Tau441 isoform (plasmid obtained from Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1–150, obtained by cloning IVA with primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) and AggDef-Tau variant (Δ275–311, purified with GGCTC5 primer) E. coli cultures were iliongezeka hadi OD600 = 0.6–0.7 kwa 37°C na 180 rpm, na kujieleza kulichochewa na IPTG kwa saa 3 kwa 37°C.Vuna seli kwa 11,500 xg kwa dakika 15 kwa 4 °C na osha kwa buffer ya salini iliyo na 150 mM NaCl.Sitisha pellet kwenye bafa ya lysis (20 ml kwa 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 50 μM, copeptin 1).Hatua ya sonication ilifanywa kwenye barafu na amplitude ya 80% kwa mipigo 10 (1 min juu, 1 min off).Usizidi 60 ml katika ultrasound moja.E. coli lysates zilipashwa moto kwa 95 ° C. kwa dakika 20, kisha kupozwa kwenye barafu na centrifuged saa 127,000×g kwa dakika 40.Dawa ya juu iliyobainishwa iliwekwa kwenye utando wa 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Uingereza) na kupigwa diali dhidi ya lita 4 za bafa ya dialysis (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mm , PMSF 0.1 mM) kwa saa 10.Safu wima ya mabadilishano ya mililita 5 (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ilisawazishwa kwa bafa ya kusawazisha (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) .Tau lysate ilichujwa kupitia kichujio cha PVDF cha 0.22 μm na kudungwa kwenye safu kwa kasi ya mtiririko wa 1 ml/min.Uchambuzi ulifanyika hatua kwa hatua, tau ilitolewa kwa 15-30% bafa ya elution (20 mm MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mm EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mm DTT, 0.1 mM PMSF).Visehemu vilichanganuliwa na SDS-PAGE, na visehemu vyovyote vilivyo na bendi moja yenye uzito unaotarajiwa wa molekuli ya tau vilikolezwa kwa kutumia kichujio cha 10 kDa centrifuge na kubadilishwa na bafa yenye 10 mm HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM na DTT 2 mM kwa mkusanyiko wa mwisho wa protini ulikuwa 100 μM.Suluhisho la protini kisha lilipitishwa kupitia chujio cha PVDF cha 0.22 μm, kugandishwa haraka na kuhifadhiwa kwa -80°C.Protein K18 ilitolewa na Prof. Alberto Boffi.Usafi wa maandalizi ulikuwa >95% kama ilivyothibitishwa na SDS-PAGE na MALDI-TOF/TOF.Cysteini mbalimbali ziliwekwa alama za kemikali na AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) au TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).zilithibitishwa na kunyonya na MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau na K18 ziliwekewa mabaki ya asili ya cysteine ​​​​katika nafasi 191 na 322 kwa kutumia Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Ujerumani) kwa kufuata utaratibu huo.Malipo halisi kwa kila ramani za masalio ya αS na Tau441 zilitolewa kwa kutumia CIDER66.
Imara ya poly-L-lysine (pLK DP 90-110 kulingana na NMR kutoka kwa msambazaji, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) iliyeyushwa katika 10 mm HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 hadi 10 mM mkusanyiko, mchakato sonicated kwa 5 dakika katika umwagaji wa maji ya ultrasonic na uhifadhi kwenye -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) na FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) ni mumunyifu wa maji na husambazwa kwa upana katika bafa ya LLPS.Dialysis huondoa chumvi zinazochafua.Kisha walichujwa kupitia chujio cha sindano yenye ukubwa wa pore ya 0.22 μm, na viwango vyao vilihesabiwa kwa kutumia refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Sampuli za LLPS zilitayarishwa kwa halijoto ya kawaida kwa mpangilio ufuatao: bafa na upanuzi zilichanganywa na tris 1 mm(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) asidi ya tetraasetiki (EDTA, carboxynth) na mchanganyiko wa 1% ya kizuizi cha protease (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Kisha αS na polycations iliyounganishwa (chaguo pLK au Tau) huongezwa.Kwa majaribio ya mfululizo wa muda wa thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, Uingereza), tumia jumla ya mkusanyiko wa ThT kuwa nusu ya mkusanyiko wa αS.Changanya kwa upole lakini kwa ukamilifu sampuli ili kuhakikisha kuwa ni sawa.Mkusanyiko wa kila kijenzi ulitofautiana kutoka kwa majaribio hadi majaribio, kama ilivyofafanuliwa katika sehemu ya Matokeo.Azide ilitumiwa katika mkusanyiko wa 0.02% (w/v) wakati wowote muda wa jaribio ulipozidi saa 4.Kwa uchanganuzi wote kwa kutumia sampuli za LLPS, ruhusu mchanganyiko kusawazisha kwa dakika 5 kabla ya uchanganuzi.Kwa uchanganuzi wa mtawanyiko mwepesi, 150 µl za sampuli zilipakiwa kwenye mikroplate za visima 96 zisizofungamana (µClear®, nyeusi, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) na kufunikwa na filamu ya kunata.LLPs zilifuatiliwa kwa kupima ufyonzaji kwa nm 350 katikati ya suluhu katika kisoma sahani cha CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Ujerumani).Majaribio yalifanywa mara tatu kwa 25°C, na makosa yalikokotolewa kama mkengeuko wa kawaida kutoka kwa wastani.Awamu ya kuzimua ilikadiriwa kwa sampuli ya uchanganuzi wa jeli na uchanganuzi wa jeli ya SDS-PAGE, na sehemu ya αS katika awamu ya kuzimua na iliyokolea ilihesabiwa katika suluhu mbalimbali za LLPS.Sampuli ya 100 μl LLPS iliyo na 1 μM AF488-yenye lebo αS ilitayarishwa kwa uchanganyaji wa kina na kufuatiwa na uwekaji katikati kwa 9600×g kwa dakika 30, baada ya hapo mvua ilionekana kwa kawaida.50 μl ya juu ya dawa ya juu zaidi ilitumika kukadiria protini kwa kutumia jeli ya SDS-PAGE.Geli zilichanganuliwa kwa vichujio vya AF488 kwa kutumia mfumo wa kupiga picha wa jeli ya ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) au kuchafuliwa na madoa ya Coomassie na kuonyeshwa kwa vichujio vinavyofaa.Bendi zilizopatikana zilichanganuliwa kwa kutumia ImageJ toleo la 1.53i (Taasisi za Kitaifa za Afya, USA).Majaribio yalifanywa kwa nakala katika majaribio mawili tofauti na matokeo sawa.
Kwa kawaida, 150 μl ya sampuli zilitumika kwa microplates zisizofungamana na visima 96 na kuonyeshwa kwenye halijoto ya kawaida kwenye darubini iliyogeuzwa ya Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Ujerumani).Kwa majaribio madoa, sahani za µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Ujerumani) au sahani ndogo za polystyrene zenye visima 96 (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) pia zilitumika.EL6000 halojeni au taa za halide za chuma za zebaki zilitumika kama vyanzo vya kuangaza (kwa BF/DIC na upigaji picha wa WF, mtawalia).Kwa hadubini ya WF, lengo la anga la kukuza 40x (Leica Microsystems, Ujerumani) lilitumiwa kuangazia mwanga kwenye sampuli na kuikusanya.Kwa sampuli zilizo na lebo za AF488 na ThT, msisimko wa chujio na utoaji na seti za kawaida za vichungi vya GFP, vichujio vya kusisimua na utoaji wa bandpass, kwa mtiririko huo, vichujio vya 460-500 nm na 512-542 nm, na kioo cha 495 nm dichroic.Kwa sampuli zilizo na lebo ya Atto647N, seti ya kawaida ya vichujio vya Cy5 vilivyo na vichungi vya msisimko na utoaji wa 628-40 nm na 692-40 nm, kwa mtiririko huo, na kioo cha 660 nm dichroic kilitumiwa.Kwa hadubini ya BF na DIC, tumia lengo sawa la kukusanya mwanga.Mwangaza uliokusanywa ulirekodiwa kwenye kamera ya Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Ujerumani).Muda wa kukaribia aliyeambukizwa ulikuwa 50 ms kwa BF na DIC upigaji picha hadubini na ms 20-100 kwa taswira ya hadubini ya WF.Kwa kulinganisha, muda wa kukaribia aliyeambukizwa kwa majaribio yote ya ThT ulikuwa 100 ms.Majaribio ya muda yalifanywa ili kuibua mshikamano wa matone, huku picha zikikusanywa kila ms 100 kwa dakika kadhaa.ImageJ (NIH, Marekani) ilitumika kwa uchanganuzi wa picha.Majaribio yalifanywa mara tatu na matokeo sawa.
Kwa majaribio ya ukoloni, ujenzi wa FRAP na 3D, picha zilipatikana kwenye darubini ya Zeiss LSM 880 iliyogeuzwa ya confocal kwa kutumia toleo la bluu la ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Ujerumani).Sampuli za 50 µl zilitumika kwa µ-Slide Angiogenesis Petri sahani (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Ujerumani), iliyotiwa na polima haidrofili (ibiTreat) na kupachikwa katika lengo la 63× la kuzamishwa kwa mafuta (Mpango-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) kwenye DIC).Picha zilipatikana kwa kutumia laini za 458 nm, 488 nm na 633 nm argon zenye ubora wa 0.26 µm/pixel na muda wa kufichua wa 8 µs/pixel kwa madirisha ya kusisimua na kugundua uchafu wa 470–600 nm, 493–628 nm, na 638–755 nm ilitumika kuibua ThT, AF488 na Atto647N, mtawalia.Kwa majaribio ya FRAP, upigaji picha wa muda wa kila sampuli ulirekodiwa kwa fremu 1 kwa sekunde.Majaribio yalifanywa mara tatu kwa joto la kawaida na matokeo sawa.Picha zote zilichanganuliwa kwa kutumia programu ya toleo la bluu la Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Ujerumani).Mikondo ya FRAP ilirekebishwa, kupangwa na kuwekwa kwa data ya ukubwa/wakati iliyotolewa kutoka kwa picha kwa kutumia Zen 2 kwa kutumia OriginPro 9.1.Mikondo ya urejeshaji iliwekwa kwa modeli ya kipeo kimoja ili kutoa hesabu ya usambaaji wa molekuli na neno la ziada la kielelezo ili kuwajibika kwa athari ya upataji wa upaukaji.Kisha tulikokotoa D kwa kutumia radius ya upaukaji ya kawaida na nusu ya maisha ya urejeshaji iliyoamuliwa hapo awali kama katika mlinganyo wa Kang et al.5 35 imeonyeshwa.
Aina moja za cysteine ​​​​za αS ziliunganishwa na 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) katika nafasi 24 (TEMPOL-24-αS) na 122 (TEMPOL-122-αS), kwa mtiririko huo.Spin Labeling Kwa majaribio ya EPR, ukolezi wa αS uliwekwa kuwa 100 μM na ukolezi wa PEG ulikuwa 15% (w/v).Kwa hali mbalimbali za kujumlisha, uwiano wa αS:pLK ulikuwa 1:10, ilhali uwiano wa αS:ΔNt-Tau na αS:Tau441 ulidumishwa katika 1:1.Kwa majaribio ya uwekaji alama ya alama bila kuwepo kwa msongamano, TEMPOL-122-αS ilidumishwa kwa 50 μM na upolimishaji uliratibiwa kwa viwango vinavyoongezeka, vikitayarisha kila hali kando.Vipimo vya CW-EPR vilifanywa kwa kutumia spectrometer ya Bruker ELEXSYS E580 X-band iliyo na resonator ya Bruker ER4118 SPT-N1 inayofanya kazi kwa mzunguko wa microwave (SHF) wa ~ 9.7 GHz.Joto liliwekwa kwa 25 ° C na kudhibitiwa na cryostat ya nitrojeni kioevu.Mtazamo ulipatikana chini ya hali isiyojaa kwa nguvu ya MW ya 4 mW, amplitude ya modulation ya 0.1 mT, na mzunguko wa modulation wa 100 kHz.Ukali wa Spectral ulirekebishwa ili kuepuka tofauti katika viwango vya spin kati ya sampuli na uwezekano wa kupunguza spin kutokana na viwango vya mabaki ya mawakala wa kupunguza katika sampuli zenye Tau441 au ΔNt-Tau (zilizopo katika suluhu za awali za protini).Thamani zilizotolewa za g zilipatikana kutokana na muundo wa kuvutia wa EPR uliotekelezwa kwa kutumia programu ya Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) iliyotekelezwa katika Matlab®67.Miundo ya isotropiki ya sehemu moja/mbili ilitumiwa kuiga data.Baada ya kusawazisha ishara zote, mabaki yalikokotolewa kwa kutoa kila simulizi kutoka kwa wigo unaolingana wa majaribio.Kwa uchanganuzi wa titration unaofungamana, ukubwa wa jamaa wa bendi ya tatu kwa mkanda wa pili wa wigo wa EPR uliorekebishwa (IIII/III) ulitumika kufuatilia ufungamanishaji wa upolimishaji kwa αS.Ili kukadiria utengano wa mara kwa mara (Kd), mkunjo unaotokana uliwekwa kwa modeli ya kukadiria ikichukua n tovuti zinazofanana na zinazojifunga.
Majaribio ya spectroscopy ya NMR yalifanywa kwa kutumia spectrometa ya NMR ya Bruker Neo 800 MHz (1H) iliyo na cryoprobe na Z-gradient.Majaribio yote yalifanywa kwa kutumia 130–207 µM αS na αS/ΔNt-Tau na pLK sawa na αS/ΔNt-Tau katika 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 na yalifanyika kwa 15°C.Ili kufuatilia LPS kwa NMR, 10% PEG iliongezwa kwenye sampuli zilizochanganywa awali.Kiwanja cha kuvuruga cha mabadiliko ya kemikali (Kielelezo 1b) kinaonyesha mabadiliko ya wastani ya 1H na 15N ya kemikali.Mwonekano wa αS 2D1H-15N HSQC ulitolewa kulingana na kazi ya awali (ingizo la BMRB #25227) na kuthibitishwa kwa kurekodi na kuchanganua mwonekano wa 3D wa HNCA, HNCO na CBCAcoNH.Mabadiliko ya kemikali ya 13Cα na 13Cβ yalikokotolewa mbele ya ΔNt-Tau au pLK ili kupima mabadiliko yanayoweza kutokea katika mwelekeo wa muundo wa pili ikilinganishwa na mabadiliko ya kemikali ya αS katika uundaji wa coil wa random 68 (Mchoro wa Nyongeza 5c).Viwango vya R1ρ vilipimwa kwa kurekodi majaribio ya hsqctretf3gpsi (yaliyopatikana kutoka kwa maktaba ya Bruker) na ucheleweshaji wa 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 na 800 ms, na utendakazi wa kielelezo ulirekebishwa hadi kilele kwa ucheleweshaji tofauti. nyakati za kuamua R1ρ na kutokuwa na uhakika wake wa majaribio.
Majaribio ya hadubini ya umeme yaliyosuluhishwa kwa muda ya rangi mbili yalifanywa kwa hadubini ya kukokotoa ya MT200 ya umeme iliyosuluhishwa kwa wakati wa kibiashara (PicoQuant, Berlin, Ujerumani) kwa kifaa cha kuhesabu fotoni (TCSPC) kinachohusiana na wakati.Kichwa cha diode ya laser hutumiwa kwa msisimko wa pulsed interleaved (PIE), boriti hupitia njia moja ya wimbi la wimbi na hupangwa kwa nguvu ya laser ya 10 hadi 100 nW kwa 481 nm na 637 nm laser mistari iliyopimwa baada ya kioo cha dichroic.Hii inahakikisha kiwango bora zaidi cha kuhesabu fotoni, kuzuia athari za kutamka kwa fotoni, upigaji picha na kueneza.Vifuniko vya μ-slaidi ya angiojenesisi ya bamba (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Ujerumani) viliwekwa moja kwa moja kwenye maji ya kuzamishwa juu ya lenzi ya Super Apochromat 60x NA 1.2 yenye kola ya kurekebisha (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Kioo cha 488/640 nm dichroic (Semrock, Lake Forest, IL, USA) kilitumika kama kipasua kikuu cha boriti.Mionzi isiyozingatia imefungwa na shimo yenye kipenyo cha microns 50, kisha mionzi iliyozingatia imegawanywa katika njia 2 za kugundua na mgawanyiko wa boriti 50/50.Vichungi vya utoaji wa bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 kwa rangi ya kijani (AF488) na 690/70 kwa rangi nyekundu (Atto647N) vilitumiwa mbele ya kigunduzi.Diodi za banguko zenye picha moja (SPAD) (Vifaa Ndogo vya Picha, Bolzano, Italia) vilitumika kama vigunduzi.Ukusanyaji na uchanganuzi wa data ulifanywa kwa kutumia programu inayopatikana kibiashara ya SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlin, Ujerumani).
Mikrolita hamsini za sampuli za LLPS ziliwekwa kwenye visima vya angiogenesis vya μ-Slaidi (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Ujerumani).Picha zinazotokana hulenga 20 µm juu ya sehemu ya chini ya kisima kwa umbali unaofaa zaidi wa kufanya kazi kwa vitone vilivyosimamishwa na hadi ~1 µm kwa vidondo na vitone vyenye mwonekano wa axial wa angalau 0.25 µm/pixel na muda wa kuchelewa wa 400 µs/pixel.Chagua data kwa kutumia kiwango cha juu zaidi kulingana na ukubwa wa wastani wa mawimbi ya usuli (PBG, wastani + 2σ) kwa kila chaneli ili matone ya protini kioevu tu, rafu au madoa yachaguliwe, na kuchuja asili yoyote inayowezekana kutoka kwa awamu iliyotawanywa.Ili kuchanganua muda wa maisha wa kila spishi (τ) ya kila mkondo (kijani, "g" kwa AF488 na nyekundu, "r" kwa Atto647N), tulichagua maeneo ya kupendeza (ROIs) yaliyo na matone, raft, au madoa (Mchoro wa Nyongeza 1). )8b) na kuzipata kwa kufaa uozo wao wa maisha ( τD, τR na τP kwa matone, rafu au madoa, mtawalia, tazama Mchoro wa Nyongeza. 8c) katika kila chaneli kwa kutumia uchanganuzi wa kutosheleza mkia na modeli ya kuoza yenye vipengele viwili.Wastani wa τ kutoka τ .ROI ambazo zilitoa fotoni chache mno kwa utoshelevu wa vipengele vingi hazikujumuishwa kwenye uchanganuzi.Kikomo kilichotumika kilikuwa < fotoni 104 za rafu na nukta na 103 za matone.Matone yana kizingiti cha chini kwa sababu ni vigumu kupata mikunjo ya kuoza yenye viwango vya juu zaidi, kwani matone katika sehemu ya picha kwa kawaida huwa madogo na si mengi.ROI zilizo na hesabu za fotoni zaidi ya kikomo cha mkusanyiko wa fotoni (zilizowekwa kuwa > hesabu 500/pixel) pia zilitupwa kwa uchanganuzi.Linganisha kiwango cha mkunjo wa kuoza uliopatikana kutoka eneo linalovutia kwa kiwango cha 90% ya kiwango cha juu (kidogo baada ya kiwango cha juu cha kuoza) tangu mwanzo wa maisha ya huduma ili kuhakikisha uingiliaji mdogo wa IRF huku ukidumisha sawa kwa kuoza kwa nguvu zote. mipangilio Dirisha la wakati wa jamaa Ilichambuliwa 25 hadi 50 ROI kwa rafts na matangazo na 15-25 ROI kwa matone, picha zilizochaguliwa kutoka kwa nakala zaidi ya 4 zilizorekodi kutoka angalau majaribio 3 ya kujitegemea.Majaribio ya T yenye mikia miwili yametumika kutathmini tofauti za takwimu kati ya spishi au kati ya mifumo ya kuunganisha.Kwa uchanganuzi wa pikseli kwa pikseli wa maisha ( τ ), jumla ya upunguzaji wa muda wa maisha kwenye uwanja kwa kila chaneli ilihesabiwa na ukadiriaji wa modeli ya upunguzaji wa vipengee 2/3 wa kipeo ulitekelezwa.Upunguzaji wa maisha kwa kila pikseli uliwekwa kwa kutumia thamani τ zilizokokotolewa hapo awali, na kusababisha picha ya pseudocolor FLIM inafaa.Muda wa maisha ya kutoshea mkia ulikuwa sawa katika picha zote za chaneli moja, na kila uozo ulitoa fotoni za kutosha ili kutoa mkao wa kutegemewa.Kwa uchanganuzi wa FRET, pikseli zilichaguliwa kwa kutumia kiwango cha chini zaidi cha fotoni 100, ambacho kilikuwa wastani wa mawimbi ya mandharinyuma (FBG) ya fotoni 11.Nguvu ya fluorescence ya kila chaneli ilirekebishwa na sababu za kusahihisha zilizoamuliwa kwa majaribio: 69 spectral crosstalk α ilikuwa 0.004, msisimko wa moja kwa moja β ulikuwa 0.0305, ufanisi wa kugundua γ ulikuwa 0.517.Ufanisi wa FRET katika kiwango cha pikseli kisha huhesabiwa kwa kutumia mlinganyo ufuatao:
ambapo FDD ni nguvu ya fluorescence inayozingatiwa katika chaneli ya wafadhili (kijani), FDA ni nguvu ya fluorescence inayozingatiwa katika chaneli ya kipokezi (nyekundu) chini ya msisimko usio wa moja kwa moja, na FAA ni nguvu ya fluorescence inayozingatiwa katika kipokezi (nyekundu) chaneli chini ya msisimko wa moja kwa moja ( PIE).Mapigo ya nguvu ya fluorescence huzingatiwa kwenye chaneli).
Weka 100 µl ya miyeyusho ya majibu ya LLPS iliyo na 25 µM isiyo na lebo ya monomeriki Tau441 (iliyo na au bila 25 µM αS) kwenye bafa ya LLPS (iliyoongezwa kama ilivyo hapo juu) kwenye mikroplate ya visima 96 isiyofungamana na mipako ya gundi ya kunata na uundaji wa matone kukaguliwa na WF. usawazishaji.ndani ya dakika 10.Baada ya masaa 48 ya incubation kwenye joto la kawaida, uwepo wa rafu za protini na matangazo ulithibitishwa.Kisha uondoe kwa uangalifu kioevu juu ya rafu kutoka kwenye visima, kisha ongeza Lita 50 za bafa ya kutenganisha (10 mm HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mm DTT) na uanguke kwa dakika 10.Mkusanyiko mkubwa wa chumvi huhakikisha kuwa LLPS haitajirudia kutokana na PEG iliyobaki, na mikusanyiko ya protini inayowezekana tu kwa mwingiliano wa kielektroniki itatenganishwa.Chini ya kisima kilifutwa kwa uangalifu na ncha ya micropipette na suluhisho lililosababishwa lilihamishiwa kwenye kisima kisicho na uchunguzi.Baada ya incubation ya sampuli na 50 μM ThT kwa h 1, uwepo wa matangazo pekee uliangaliwa na microscopy ya WF.Andaa nyuzinyuzi za sonicated αS kwa kuachilia 300 µl ya myeyusho wa 70-µM αS katika PBS yenye pH 7.4, azide ya sodiamu 0.01% kwa 37 °C na 200 rpm kwenye shaker ya orbital kwa siku 7.Suluhisho lilikuwa kisha centrifuged saa 9600 × g kwa dakika 30, pellet ilikuwa resuspended katika PBS pH 7.4 na sonicated (1 min, 50% mzunguko, 80% amplitude katika Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) sampuli fibril. na usambazaji wa saizi ya sare ya nyuzi ndogo.
Uchanganuzi wa FCS/FCCS na ugunduzi wa matukio ya rangi mbili (TCCD) ulifanywa kwa hadubini ile ile ya umeme iliyosuluhishwa ya MT200 (Pico-Quant, Berlin, Ujerumani) iliyotumika kwa majaribio ya hadubini ya FLIM-FRET kwa kutumia modi ya PIE.Nguvu ya leza ya majaribio haya iliongezwa kwa 6.0 µW (481 nm) na 6.2 µW (637 nm).Mchanganyiko wa nguvu hizi za leza ulichaguliwa ili kutoa mwangaza sawa kwa jozi za fluorophores zinazotumiwa huku kukiwa na viwango bora vya hesabu na kuepuka upigaji picha na kueneza.Ukusanyaji na uchanganuzi wa data ulifanywa kwa kutumia programu inayopatikana kibiashara ya SymphoTime64 toleo la 2.3 (PicoQuant, Berlin, Ujerumani).
Sampuli za mijumuisho ya αS/Tau iliyotengwa iliyopatikana kwa kutumia LLPS hutiwa katika bafa ya kutengwa hadi ukolezi unaofaa wa molekuli monomolekuli (kawaida myeyusho wa 1:500, kwa kuwa hesabu tayari ziko katika viwango vya chini zinapotengwa kutoka kwa sampuli za coacervate).Sampuli ziliwekwa moja kwa moja kwenye vifuniko (Corning, USA) vilivyopakwa awali myeyusho wa BSA katika mkusanyiko wa 1 mg/mL.
Kwa uchanganuzi wa PIE-smFRET katika chaneli za kijani na nyekundu, kiwango cha chini cha kiwango cha fotoni 25 kilitumika ili kuchuja mawimbi ya nguvu ya chini yanayosababishwa na matukio ya monomeriki (kumbuka kuwa monoma huzidi sampuli zilizojumlishwa ikilinganishwa na mkusanyiko uliotengwa).Kiwango hiki kilihesabiwa kuwa mara tano ya ukubwa wa wastani wa αS wa monomeri iliyopatikana kutokana na uchanganuzi wa sampuli za monoma safi ili kuchagua mahususi mkusanyiko wa uchanganuzi.Mzunguko wa kiendeshi cha PIE, pamoja na upataji wa data wa TSCPC, umewezesha utumizi wa kichujio cha uzani cha maisha yote ambacho husaidia kuondoa usuli na mazungumzo ya taswira.Kiwango cha mwako kilichochaguliwa kwa kutumia vizingiti vilivyo hapo juu kilirekebishwa kwa kutumia mawimbi ya mandharinyuma ya wastani yaliyobainishwa kutoka kwa histogramu ya tukio dhidi ya ukubwa/bin ya sampuli za bafa pekee.Milipuko inayohusishwa na mijumuisho mikubwa kwa kawaida huchukua mapipa kadhaa mfululizo katika ufuatiliaji wa muda (imewekwa kwa 1 ms).Katika kesi hizi, bin ya nguvu ya juu ilichaguliwa.Kwa uchanganuzi wa FRET na stoichiometric, kipengele cha gamma kilichobainishwa kinadharia γ (0.517) kilitumika.Mazungumzo ya kimaadili na michango ya uchochezi ya moja kwa moja haikubaliki (imeamuliwa kwa majaribio) kwa nguvu ya leza ya msisimko inayotumika.Ufanisi na stoichiometry ya FRET katika mlipuko huhesabiwa kama ifuatavyo.