Asante kwa kutembelea Nature.com.Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Vitelezi vinavyoonyesha makala tatu kwa kila slaidi.Tumia vitufe vya nyuma na vinavyofuata ili kusogeza kwenye slaidi, au vitufe vya kidhibiti cha slaidi mwishoni ili kusogea kwenye kila slaidi.

317 Wasambazaji wa neli za chuma cha pua

Jedwali la utungaji wa kemikali ya nyenzo za chuma cha pua

SPCA6 ni protini ya uso inayoonyeshwa na manii ambayo ni muhimu kwa muunganisho wa gamete wakati wa uzazi wa mamalia.Licha ya jukumu hili la msingi, kazi maalum ya SPCA6 haieleweki vizuri.Tunafafanua muundo wa fuwele wa kikoa cha ziada cha SPCA6 kwa azimio la 2.2 Å, tukifichua protini ya vikoa viwili inayojumuisha kifungu cha mistari minne na sandwichi za Ig-kama β zilizounganishwa na viunganishi vinavyoweza kunyumbulika.Muundo huu unafanana na IZUMO1, protini nyingine inayohusishwa na muunganisho wa gamete, na kufanya SPCA6 na IZUMO1 waanzilishi wa familia kuu ya protini zinazohusiana na urutubishaji zinazorejelewa humu kama familia kuu ya IST.Familia kuu ya IST imefafanuliwa kimuundo kwa kifungu chake cha helix nne kilichosokotwa na jozi ya motifu za CXXC zilizounganishwa na disulfidi.Utafutaji wa muundo wa AlphaFold wa proteome ya binadamu ulitambua washiriki wa ziada wa protini wa familia hii kuu;haswa, nyingi za protini hizi zinahusika katika muunganisho wa gamete.Muundo wa SPCA6 na uhusiano wake na washiriki wengine wa familia kuu ya IST hutoa kiungo kinachokosekana katika ujuzi wetu wa muunganisho wa gamete ya mamalia.
Kila maisha ya mwanadamu huanza na gamete mbili tofauti za haploid: manii ya baba na yai la mama.Mbegu hii ni mshindi wa mchakato mkali wa uteuzi wakati mamilioni ya seli za manii hupitia njia ya uzazi ya mwanamke, kushinda vikwazo mbalimbali1 na kupitia capacitation, ambayo huongeza motility yao na mchakato wa vipengele vya uso2,3,4.Hata ikiwa manii na oocyte hupata kila mmoja, mchakato bado haujaisha.Oocyte imezungukwa na safu ya seli za cumulus na kizuizi cha glycoprotein kinachoitwa zona pellucida, ambayo manii lazima ipite ili kuingia oocyte.Spermatozoa hutumia mchanganyiko wa molekuli za kushikamana kwa uso na vimeng'enya vinavyohusishwa na utando na kufichwa ili kushinda vizuizi hivi vya mwisho5.Molekuli hizi na vimeng'enya huhifadhiwa hasa katika utando wa ndani na matriki ya akrosomal na hugunduliwa wakati utando wa nje wa manii unapowekwa kwenye lysed wakati wa mmenyuko wa acrosomal.Hatua ya mwisho katika safari hii kali ni tukio la muunganisho wa yai la manii, ambapo seli mbili huunganisha utando wao na kuwa kiumbe kimoja cha diplodi7.Ingawa mchakato huu ni wa msingi katika uzazi wa binadamu, mwingiliano muhimu wa molekuli haueleweki vizuri.
Mbali na mbolea ya gametes, kemia ya fusion ya bilayers mbili za lipid imejifunza sana.Kwa ujumla, muunganisho wa utando ni mchakato usiofaa kwa nguvu ambao unahitaji kichocheo cha protini ili kupitia mabadiliko ya muundo wa muundo ambao huleta utando mbili karibu, kuvunja mwendelezo wao na kusababisha muunganisho8,9.Vichocheo hivi vya protini vinajulikana kama fusojeni na vimepatikana katika mifumo mingi ya muunganisho.Zinahitajika kwa ajili ya kuingia kwa virusi kwenye chembe chembe za seli (kwa mfano, gp160 katika VVU-1, kuongezeka kwa virusi vya corona, hemagglutinin katika virusi vya mafua)10,11,12 kondo (syncytin)13,14,15 na miunganisho ya kutengeneza gamete kwenye yukariyoti ya chini ( HAP2/GCS1 katika mimea, wasanii na arthropods) 16,17,18,19.Fusojeni za gamete za binadamu bado hazijagunduliwa, ingawa protini kadhaa zimeonyeshwa kuwa muhimu kwa kushikamana na kuunganishwa kwa gamete.CD9 inayoonyeshwa na oocyte, protini ya transmembrane inayohitajika kwa muunganisho wa panya na chembe za binadamu, ilikuwa ya kwanza kugunduliwa 21,22,23.Ingawa utendakazi wake madhubuti bado haujaeleweka, jukumu katika kushikamana, muundo wa foci ya wambiso kwenye microvilli ya yai, na/au ujanibishaji sahihi wa protini za uso wa oocyte inaonekana uwezekano wa 24,25,26.Protini mbili za kawaida ambazo ni muhimu kwa muunganisho wa gameti ni protini ya manii IZUMO127 na protini ya oocyte JUNO28, na uhusiano wao wa pande zote ni hatua muhimu katika utambuzi na kushikamana kwa gameti kabla ya kuunganishwa.Panya wa kiume wa Izumo1 na panya wa kike wa Juno ni tasa kabisa, katika aina hizi za manii huingia kwenye nafasi ya perivitelline lakini gamete haziunganishi.Vile vile, muunganisho ulipunguzwa wakati gametes zilipotibiwa na kingamwili za anti-IZUMO1 au JUNO27,29 katika majaribio ya urutubishaji wa binadamu katika vitro.
Hivi majuzi, kikundi kipya cha protini zinazoonyeshwa na manii sawa na IZUMO1 na JUNO20,30,31,32,33,34,35 kimegunduliwa.Protini 6 inayohusishwa na utando wa acrosomal ya manii (SPCA6) imetambuliwa kuwa muhimu kwa ajili ya kurutubisha katika utafiti mkubwa wa mutagenesis ya murine.Uingizaji wa transgene katika jeni la Spaca6 hutoa spermatozoa isiyoweza kuharibika, ingawa manii hizi hupenya nafasi ya perivitelline 36 .Masomo yaliyofuata ya mtoano katika panya yalithibitisha kuwa Spaca6 inahitajika kwa muunganisho wa gamete 30,32.SPCA6 inaonyeshwa kwa karibu pekee katika korodani na ina muundo wa ujanibishaji sawa na ule wa IZUMO1, yaani ndani ya intima ya manii kabla ya mmenyuko wa akrosomal, na kisha huhamia eneo la ikweta baada ya mmenyuko wa 30,32.Homologi za Spaca6 zipo katika aina mbalimbali za mamalia na yukariyoti 30 na umuhimu wake kwa muunganisho wa gameti ya binadamu umeonyeshwa kwa kuzuiwa kwa urutubishaji wa binadamu katika vitro kwa upinzani dhidi ya SPCA6 30.Tofauti na IZUMO1 na JUNO, maelezo ya muundo, mwingiliano, na kazi ya SPCA6 bado hayaeleweki.
Ili kuelewa vyema mchakato wa kimsingi unaotokana na muunganisho wa manii na mayai ya binadamu, ambao utatuwezesha kufahamisha maendeleo ya baadaye katika upangaji uzazi na matibabu ya uwezo wa kushika mimba, tulifanya tafiti za miundo na biokemikali za SPCA6.Muundo wa fuwele wa kikoa cha ziada cha SPCA6 unaonyesha kifurushi cha helical nne (4HB) na kikoa cha immunoglobulin-kama (Ig-kama) kilichounganishwa na maeneo ambayo yanaweza kunyumbulika.Kama ilivyotabiriwa katika tafiti zilizopita,7,32,37 muundo wa kikoa wa SPCA6 unafanana na ule wa IZUMO1 ya binadamu, na protini hizo mbili zinashiriki motifu isiyo ya kawaida: 4HB yenye uso wa helikosi ya pembe tatu na jozi ya motifu za CXXC zilizounganishwa na disulfidi.Tunapendekeza kwamba IZUMO1 na SPCA6 sasa zifafanue familia kubwa zaidi, inayohusiana kimuundo ya protini zinazohusiana na muunganisho wa gamete.Kwa kutumia vipengele vya kipekee kwa familia kuu, tulifanya utafutaji wa kina wa proteome ya miundo ya binadamu ya AlphaFold, kubainisha washiriki wa ziada wa familia hii bora zaidi, ikijumuisha wanafamilia kadhaa wanaohusika katika muunganisho wa gamete na/au urutubishaji.Sasa inaonekana kwamba kuna mkunjo wa kawaida wa kimuundo na familia kuu ya protini zinazohusishwa na muunganisho wa gamete, na muundo wetu hutoa ramani ya molekuli ya kipengele hiki muhimu cha utaratibu wa muunganisho wa gameti ya binadamu.
SPCA6 ni protini ya transmembrane ya pasi moja yenye glycan moja iliyounganishwa na N na vifungo sita vya kuweka disulfidi (Takwimu S1a na S2).Tulielezea kikoa cha ziada cha SPCA6 ya binadamu (mabaki 27-246) katika seli za Drosophila S2 na kutakasa protini kwa kutumia upatanishi wa nikeli, ubadilishanaji wa mawasiliano, na kromatografia ya kutojumuisha ukubwa (Mchoro S1b).Ectodomain ya SPCA6 iliyosafishwa ni thabiti sana na ni sawa.Uchambuzi kwa kutumia kromatografia ya kutojumuisha saizi pamoja na mtawanyiko wa nuru ya poligonal (SEC-MALS) ulifunua kilele kimoja na uzani wa molekuli uliokokotwa wa 26.2 ± 0.5 kDa (Mchoro S1c).Hii inalingana na ukubwa wa ectodomain ya SPCA6, inayoonyesha kuwa oligomerization haikutokea wakati wa utakaso.Kwa kuongeza, uchunguzi wa dichroism ya mviringo (CD) ulifunua muundo wa mchanganyiko wa α / β na kiwango cha kuyeyuka cha 51.3 ° C (Mchoro S1d, e).Deconvolution ya spectra ya CD ilifichua 38.6% α-helical na 15.8% β-stranded vipengele (Kielelezo S1d).
Ectodomain ya SPCA6 iliangaziwa kwa kutumia mbegu za matriki bila mpangilio38 na kusababisha seti ya data yenye azimio la 2.2 Å (Jedwali 1 na Kielelezo S3).Kwa kutumia mchanganyiko wa ubadilishaji wa molekuli kulingana na vipande na data ya awamu ya SAD na udhihirisho wa bromidi kwa uamuzi wa muundo (Jedwali la 1 na Kielelezo S4), kielelezo cha mwisho kilichosafishwa kina mabaki 27-246.Wakati muundo ulipoamuliwa, hapakuwa na miundo ya majaribio au AlphaFold inayopatikana.Ectodomain ya SPCA6 hupima 20 Å × 20 Å × 85 Å, ina helis saba na nyuzi tisa za β, na ina mikunjo ya elimu ya juu iliyoimarishwa na vifungo sita vya disulfide (Mchoro 1a, b).Msongamano dhaifu wa elektroni mwishoni mwa mnyororo wa upande wa Asn243 unaonyesha kuwa mabaki haya ni glycosylation iliyounganishwa na N.Muundo una vikoa viwili: kifungu cha N-terminal cha helix nne (4HB) na kikoa cha C-terminal Ig-kama na eneo la kati la bawaba kati yao (Mchoro 1c).
Muundo wa kikoa cha ziada cha SPCA6.Mchoro wa mstari wa kikoa cha ziada cha SPCA6, rangi ya mnyororo kutoka N hadi C-terminus kutoka bluu iliyokolea hadi nyekundu iliyokolea.Cysteines zinazohusika katika vifungo vya disulfide zinaonyeshwa kwenye magenta.b Topolojia ya kikoa cha ziada cha SPCA6.Tumia mpango wa rangi sawa na kwenye Mchoro 1a.c SPCA6 kikoa nje ya seli.Chati za 4HB, bawaba, na ukanda wa kikoa unaofanana na Ig zina rangi ya chungwa, kijani kibichi na buluu, mtawalia.Tabaka hazijatolewa kwa kiwango.
Kikoa cha 4HB cha SPCA6 kinajumuisha heli nne kuu (heli 1-4), ambazo zimepangwa kwa namna ya helix ya helical (Mchoro 2a), kubadilishana kati ya mwingiliano wa antiparallel na sambamba (Mchoro 2b).Hesi ndogo ya ziada ya zamu moja (hesi 1′) imewekwa kwa usawa kwa kifungu, na kutengeneza pembetatu na heli 1 na 2. Pembetatu hii imeharibika kidogo katika ufungaji wa helical-twisted ya kufunga mnene wa heli 3 na 4 ( Kielelezo 2a).
Chati ya ukanda wa 4HB N-terminal.b Mwonekano wa juu wa rundo la helikopta nne, kila hesi ikiangaziwa kwa samawati iliyokolea kwenye sehemu ya N-terminus na nyekundu iliyokolea kwenye C-terminus.c Mchoro wa gurudumu la ond-chini la 4HB, huku kila masalio yakionyeshwa kama mduara ulio na msimbo wa amino asidi ya herufi moja;ni asidi nne tu za amino zilizo juu ya gurudumu ndizo zimehesabiwa.Mabaki yasiyo ya polar yana rangi ya njano, mabaki ya polar ambayo hayajachajiwa yana rangi ya kijani, mabaki yenye chaji chanya yana rangi ya samawati, na mabaki yenye chaji hasi yana rangi nyekundu.d Nyuso za pembetatu za kikoa cha 4HB, zenye 4HB za rangi ya chungwa na bawaba za kijani.Vipengee vyote viwili vinaonyesha miunganisho ya disulfidi yenye umbo la fimbo.
4HB imejikita kwenye kiini cha ndani cha haidrofobu kinachojumuisha hasa mabaki ya alifatiki na kunukia (Mchoro 2c).Kiini kina dhamana ya disulfidi kati ya Cys41 na Cys55 inayounganisha helis 1 na 2 pamoja katika pembetatu iliyoinuliwa juu (Mchoro 2d).Vifungo viwili vya ziada vya disulfide viliundwa kati ya motif ya CXXC katika Helix 1′ na motif nyingine ya CXXC iliyopatikana kwenye ncha ya β-hairpin katika eneo la bawaba (Mchoro 2d).Mabaki ya arginine ya kihafidhina yenye kazi isiyojulikana (Arg37) iko ndani ya pembetatu tupu inayoundwa na helis 1′, 1, na 2. Atomi za kaboni aliphatic Cβ, Cγ, na Cδ Arg37 huingiliana na kiini cha haidrofobu, na vikundi vyake vya guanidine husogea kwa mzunguko. kati ya helis 1′ na 1 kupitia mwingiliano kati ya mgongo wa Thr32 na mnyororo wa upande (Mchoro S5a, b).Tyr34 inaenea ndani ya shimo na kuacha mashimo mawili madogo ambayo Arg37 inaweza kuingiliana na kutengenezea.
Vikoa vya Ig-kama β-sandwich ni jamii kubwa ya protini zinazoshiriki kipengele cha kawaida cha karatasi mbili au zaidi za amfipathiki zenye mistari mingi zinazoingiliana kupitia msingi wa haidrofobu 39. Kikoa cha C-terminal Ig-kama cha SPCA6 kina muundo sawa. na lina tabaka mbili (Mchoro S6a).Laha 1 ni beta ya nyuzi nne (nyuzi D, F, H, na I) ambapo nyuzi F, H, na mimi huunda mpangilio wa kupinga ulinganifu, na nyuzi I na D huchukua mwingiliano sambamba.Jedwali la 2 ni karatasi ndogo ya beta ya kupambana na sambamba yenye nyuzi mbili (nyuzi E na G).Dhamana ya ndani ya disulfide ilizingatiwa kati ya C-terminus ya mlolongo wa E na katikati ya mlolongo wa H (Cys170-Cys226) (Mchoro S6b).Dhamana hii ya disulfidi ni sawa na dhamana ya disulfidi katika kikoa cha β-sandwich cha immunoglobulin40,41.
Laha-beta ya nyuzi nne hujipinda kwa urefu wake wote, na kutengeneza kingo zisizolingana ambazo hutofautiana kwa umbo na tuati za kielektroniki.Ukingo mwembamba zaidi ni uso wa mazingira tambarare wa haidrofobu ambao hujitokeza ukilinganisha na nyuso zilizosalia zisizo sawa na tofauti za kielektroniki katika SPCA6 (Mchoro S6b, c).Halo ya makundi ya uti wa mgongo wa kabonili/amino na minyororo ya kando ya polar huzunguka uso wa haidrofobu (Mchoro S6c).Upeo mpana zaidi unafunikwa na sehemu ya helical iliyofungwa ambayo huzuia sehemu ya N-terminal ya msingi wa hidrofobi na kuunda vifungo vitatu vya hidrojeni na kundi la polar la wazi la uti wa mgongo wa mnyororo wa F (Mchoro S6d).Sehemu ya C-terminal ya makali hii huunda mfukoni mkubwa na msingi wa hidrofobi uliofunuliwa kwa sehemu.Mfukoni umezungukwa na malipo chanya kutokana na seti tatu za mabaki ya arginine mara mbili (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 na Arg212-Arg214) na histidine ya kati (His220) (Kielelezo S6e).
Eneo la bawaba ni sehemu fupi kati ya kikoa cha helical na kikoa kinachofanana na Ig, kinachojumuisha safu moja ya β-ya safu tatu ya antiparallel (nyuzi A, B na C), hesi ndogo ya 310, na sehemu kadhaa za muda mrefu za helical.(Mchoro S7).Mtandao wa mawasiliano ya ushirikiano na ya kielektroniki katika eneo la bawaba inaonekana kuleta uelekeo kati ya 4HB na kikoa kinachofanana na Ig.Mtandao unaweza kugawanywa katika sehemu tatu.Sehemu ya kwanza inajumuisha motifu mbili za CXXC (27CXXC30 na 139CXXC142) ambazo huunda jozi ya vifungo vya disulfide kati ya β-hairpin kwenye bawaba na 1′ hesi katika 4HB.Sehemu ya pili inajumuisha mwingiliano wa kielektroniki kati ya kikoa kama cha Ig na bawaba.Glu132 kwenye bawaba huunda daraja la chumvi na Arg233 kwenye kikoa kama cha Ig na Arg135 kwenye bawaba.Sehemu ya tatu inajumuisha dhamana ya ushirikiano kati ya kikoa cha Ig-kama na eneo la bawaba.Vifungo viwili vya disulfidi (Cys124-Cys147 na Cys128-Cys153) huunganisha kitanzi cha bawaba kwenye kiunganishi ambacho kimeimarishwa na mwingiliano wa kielektroniki kati ya Gln131 na kikundi kinachofanya kazi cha uti wa mgongo, ikiruhusu ufikiaji wa kikoa cha kwanza kama Ig.mnyororo.
Muundo wa ectodomain ya SPCA6 na miundo ya mtu binafsi ya vikoa 4HB na Ig-kama ilitumiwa kutafuta rekodi zinazofanana kimuundo katika hifadhidata za protini 42 .Tulitambua mechi zilizo na alama za juu za Dali Z, mkengeuko mdogo wa kiwango, na alama kubwa za LALI (ya mwisho ikiwa ni idadi ya mabaki yanayolingana kimuundo).Ingawa vibao 10 vya kwanza kutoka kwa utafutaji kamili wa ectodomain (Jedwali S1) vilikuwa na alama ya Z inayokubalika ya >842, utafutaji wa kikoa cha 4HB au Ig-kama pekee ulionyesha kuwa nyimbo nyingi hizi zililingana na sandwiches pekee.mkunjo unaopatikana kila mahali katika protini nyingi.Utafutaji wote watatu katika Dali ulileta tokeo moja pekee: IZUMO1.
Imependekezwa kwa muda mrefu kuwa SPCA6 na IZUMO1 zishiriki ufanano wa kimuundo7,32,37.Ingawa ectodomain za protini hizi mbili zinazohusiana na muunganisho wa gamete hushiriki utambulisho wa mfuatano wa 21% pekee (Kielelezo S8a), ushahidi changamano, ikiwa ni pamoja na muundo wa dhamana ya disulfidi iliyohifadhiwa na kikoa kilichotabiriwa cha C-terminal Ig-kama katika SPCA6, kiliruhusu majaribio ya mapema ya kujenga mfano wa homolojia wa A kipanya SPCA6 kwa kutumia IZUMO1 kama kiolezo37.Muundo wetu unathibitisha utabiri huu na unaonyesha kiwango cha kweli cha kufanana.Kwa hakika, miundo ya SPCA6 na IZUMO137,43,44 inashiriki usanifu sawa wa vikoa viwili (Mchoro S8b) na vikoa sawa vya 4HB na Ig-kama β-sandwich vilivyounganishwa na eneo la bawaba (Mchoro S8c).
IZUMO1 na SPCA6 4HB zina tofauti za kawaida kutoka kwa vifurushi vya kawaida vya ond.4HB za kawaida, kama zile zinazopatikana katika chanjo za protini za SNARE zinazohusika na muunganisho wa endosomal 45,46, zina helikopta zenye nafasi sawa zinazodumisha mkunjo wa mara kwa mara kuzunguka mhimili wa kati 47. Kinyume chake, vikoa vya helikali katika IZUMO1 na SPCA6 vilipotoshwa, vikiwa na mkunjo tofauti na kufunga kwa usawa (Kielelezo S8d).Msokoto, pengine unasababishwa na pembetatu inayoundwa na helisi 1′, 1 na 2, huhifadhiwa katika IZUMO1 na SPCA6 na kuimarishwa na motifu sawa ya CXXC kwenye hesi 1′.Hata hivyo, dhamana ya ziada ya disulfidi inayopatikana katika SPCA6 (Cys41 na Cys55 inayounganisha helis 1 na 2 hapo juu) huunda kilele chenye ncha kali zaidi kwenye kilele cha pembetatu, na kufanya SPCA6 kujipinda zaidi kuliko IZUMO1, na pembetatu ya matundu iliyotamkwa zaidi.Kwa kuongeza, IZUMO1 haina Arg37 iliyozingatiwa katikati ya cavity hii katika SPCA6.Kinyume chake, IZUMO1 ina msingi wa haidrofobu wa kawaida zaidi wa mabaki ya alifati na kunukia.
IZUMO1 ina kikoa kinachofanana na Ig kinachojumuisha β-sheet43 yenye nyuzi mbili na yenye nyuzi tano.Uzio wa ziada katika IZUMO1 unachukua nafasi ya koili katika SPCA6, ambayo huingiliana na uzi wa F ili kupunguza vifungo vya uti wa mgongo wa hidrojeni kwenye uzi.Jambo la kuvutia la kulinganisha ni malipo ya uso yaliyotabiriwa ya vikoa kama Ig vya protini hizo mbili.Uso wa IZUMO1 una chaji mbaya zaidi kuliko uso wa SPCA6.Chaji ya ziada iko karibu na C-terminus inayokabili utando wa manii.Katika SPCA6, mikoa hiyo hiyo ilikuwa ya neutral zaidi au chaji chanya (Mchoro S8e).Kwa mfano, uso wa haidrofobu (kingo nyembamba zaidi) na mashimo yaliyo na chaji chanya (kingo pana) katika SPCA6 yamechajiwa vibaya katika IZUMO1.
Ingawa uhusiano na vipengele vya muundo wa pili kati ya IZUMO1 na SPCA6 vimehifadhiwa vizuri, upatanishi wa kimuundo wa vikoa kama vya Ig ulionyesha kuwa vikoa viwili vinatofautiana katika mwelekeo wao wa jumla kuhusiana na kila mmoja (Mchoro S9).Kifurushi cha ond cha IZUMO1 kimejipinda karibu na sandwich, na kuunda umbo la "boomerang" lililoelezewa hapo awali karibu 50 ° kutoka kwa mhimili wa kati.Kinyume chake, boriti ya helical katika SPCA6 iliinamishwa takriban 10° kinyume.Tofauti katika mielekeo hii inawezekana kutokana na tofauti katika eneo la bawaba.Katika kiwango cha mfuatano wa msingi, IZUMO1 na SPCA6 zina ufanano mdogo wa mfuatano kwenye bawaba, isipokuwa cysteine, glycine, na mabaki ya asidi aspartic.Matokeo yake, vifungo vya hidrojeni na mitandao ya umeme ni tofauti kabisa.Vipengee vya muundo wa upili wa laha β vinashirikiwa na IZUMO1 na SPCA6, ingawa minyororo katika IZUMO1 ni mirefu zaidi na helix 310 (helix 5) ni ya kipekee kwa SPCA6.Tofauti hizi husababisha mwelekeo tofauti wa kikoa kwa protini mbili zinazofanana.
Utafutaji wetu wa seva ya Dali ulibaini kuwa SPCA6 na IZUMO1 ndizo miundo miwili pekee iliyoamuliwa kwa majaribio iliyohifadhiwa katika hifadhidata ya protini ambayo ina mkunjo huu wa 4HB (Jedwali S1).Hivi majuzi, DeepMind (Alfabeti/Google) imeunda AlphaFold, mfumo wa msingi wa mtandao wa neva ambao unaweza kutabiri kwa usahihi miundo ya 3D ya protini kutoka kwa mfuatano wa kimsingi48.Muda mfupi baada ya sisi kutatua muundo wa SPCA6, hifadhidata ya AlphaFold ilitolewa, ikitoa miundo ya ubashiri inayofunika 98.5% ya protini zote katika proteome48,49 ya binadamu.Kwa kutumia muundo wetu wa SPCA6 uliotatuliwa kama kielelezo cha utafutaji, utafutaji wa homolojia wa muundo wa kielelezo katika proteome ya binadamu ya AlphaFold ulibainisha watahiniwa wenye uwezekano wa mfanano wa kimuundo wa SPCA6 na IZUMO1.Kwa kuzingatia usahihi wa ajabu wa AlphaFold katika kutabiri SPCA6 (Mtini. S10a)—hasa 1.1 Å rms ectodomain ikilinganishwa na muundo wetu uliotatuliwa (Mtini. S10b)—tunaweza kuwa na uhakika kwamba mechi zilizotambuliwa za SPCA6 huenda zikawa sahihi.
Hapo awali, PSI-BLAST ilitafuta nguzo ya IZUMO1 yenye protini nyingine tatu zinazohusiana na manii: IZUMO2, IZUMO3, na IZUMO450.AlphaFold ilitabiri kuwa protini hizi za familia za IZUMO hujikunja katika kikoa cha 4HB zikiwa na muundo wa bondi ya disulfidi sawa na IZUMO1 (Kielelezo 3a na S11), ingawa hazina kikoa kinachofanana na Ig.Inakisiwa kuwa IZUMO2 na IZUMO3 ni protini za utando wa upande mmoja sawa na IZUMO1, huku IZUMO4 ikionekana kuwa imetolewa.Kazi za protini za IZUMO 2, 3, na 4 katika muunganisho wa gamete hazijabainishwa.IZUMO3 inajulikana kuwa na jukumu la akrosome biogenesis wakati wa ukuzaji wa spermatozoa51, na protini ya IZUMO huunda changamano50.Uhifadhi wa protini za IZUMO katika mamalia, reptilia na amfibia unapendekeza kwamba uwezo wao wa kufanya kazi unalingana na ule wa protini nyingine zinazojulikana zinazohusiana na gamete-fusion, kama vile DCST1/2, SOF1, na FIMP.
Mchoro wa usanifu wa kikoa cha familia kuu ya IST, yenye 4HB, bawaba, na vikoa vinavyofanana na Ig vilivyoangaziwa katika rangi ya chungwa, kijani kibichi na buluu, mtawalia.IZUMO4 ina eneo la kipekee la C-terminal ambayo inaonekana nyeusi.Vifungo vya disulfidi vilivyoidhinishwa na vilivyowekwa vinaonyeshwa kwa mistari thabiti na yenye nukta, mtawalia.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPCA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95), na AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) zinaonyeshwa katika safu ya rangi sawa na paneli A. Vifungo vya disulfide vinaonyeshwa katika majenta.Heli za transmembrane za TMEM95, IZUMO2 na IZUMO3 hazionyeshwa.
Tofauti na protini ya IZUMO, protini nyingine za SPCA (yaani, SPCA1, SPCA3, SPCA4, SPCA5, na SPCA9) zinadhaniwa kuwa tofauti kimuundo na SPCA6 (Mchoro S12).SPCA9 pekee ndiyo iliyo na 4HB, lakini haitarajiwi kuwa na uelekeo sawia wa kupambana na sambamba au dhamana ya disulfidi sawa na SPCA6.SPCA1 pekee ndiyo iliyo na kikoa sawa cha Ig.AlphaFold inatabiri kuwa SPCA3, SPCA4 na SPCA5 zina muundo tofauti kabisa na SPCA6.Inafurahisha, SPCA4 pia inajulikana kuwa na jukumu katika utungishaji, lakini kwa kiwango kikubwa kuliko SPCA6, badala yake kuwezesha mwingiliano kati ya manii na oocyte zona pellucida52.
Utafutaji wetu wa AlphaFold umepata ulinganifu mwingine wa IZUMO1 na SPCA6 4HB, TMEM95.TMEM95, protini moja maalum ya manii ya transmembrane, hufanya panya wa kiume kuwa wagumba wanapopunguzwa 32,33.Spermatozoa isiyo na TMEM95 ilikuwa na morphology ya kawaida, motility, na uwezo wa kupenya zona pellucida na kumfunga kwenye membrane ya yai, lakini haikuweza kuunganisha na membrane ya oocyte.Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa TMEM95 inashiriki mfanano wa kimuundo na IZUMO133.Hakika, muundo wa AlphaFold ulithibitisha kuwa TMEM95 ni 4HB yenye jozi sawa za motifu za CXXC kama IZUMO1 na SPCA6 na kifungo sawa cha ziada cha disulfidi kati ya helikopta 1 na 2 zinazopatikana katika SPCA6 (Mchoro 3a na S11).Ingawa TMEM95 haina kikoa kinachofanana na Ig, ina eneo lenye muundo wa dhamana ya disulfidi sawa na maeneo ya bawaba ya SPCA6 na IZUMO1 (Mchoro 3b).Wakati wa kuchapishwa kwa muswada huu, seva ya machapisho ya awali iliripoti muundo wa TMEM95, ikithibitisha matokeo ya AlphaFold53.TMEM95 inafanana sana na SPCA6 na IZUMO1 na inahifadhiwa kimageuzi tayari katika amfibia (Mchoro 4 na S13).
Utafutaji wa PSI-BLAST ulitumia hifadhidata za NCBI SPCA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, na SOF1 ili kubainisha nafasi ya mfuatano huu katika mti wa uzima.Umbali kati ya sehemu za tawi hauonyeshwa kwa kiwango.
Ulinganifu wa jumla wa kushangaza kati ya SPCA6 na IZUMO1 unapendekeza kuwa wao ni washiriki waanzilishi wa familia bora ya kimuundo inayojumuisha TMEM95 na IZUMO 2, 3, na 4 protini.wanachama wanaojulikana: IZUMO1, SPCA6 na TMEM95.Kwa sababu ni washiriki wachache tu walio na vikoa vinavyofanana na Ig, sifa mahususi ya familia kuu ya IST ni kikoa cha 4HB, ambacho kina vipengele vya kipekee vinavyofanana na protini hizi zote: 1) 4HB iliyounganishwa na helis iliyopangwa kwa mpigo wa kuzuia-sambamba/sambamba (Mtini. . 5a), 2) kifurushi kina uso wa pembe tatu unaojumuisha helis mbili ndani ya kifurushi na hesi ya tatu wima (Mtini. eneo muhimu (Mchoro 5c). Motifu ya CXXC, inayopatikana katika protini zinazofanana na thioredoxin, inajulikana kufanya kazi. kama kihisi redoksi 54,55,56 , ilhali motifu katika wanafamilia wa IST inaweza kuhusishwa na isomerasi za disulfide ya protini kama vile ERp57 katika muunganisho wa gamete. Majukumu yanahusishwa 57,58.
Wanachama wa familia kuu ya IST wanafafanuliwa kwa vipengele vitatu bainifu vya kikoa cha 4HB: helikopta nne zinazopishana kati ya mwelekeo sawia na unaopingana, nyuso za ba-triangular helical bundle, na ca ca CXXC motifu mbili iliyoundwa kati ya molekuli ndogo.) N-terminal helixes (machungwa) na mkoa wa bawaba β-hairpin (kijani).
Kwa kuzingatia ufanano kati ya SPCA6 na IZUMO1, uwezo wa ile ya awali kuunganisha kwa IZUMO1 au JUNO ulijaribiwa.Biolayer interferometry (BLI) ni mbinu ya kuunganisha inayotegemea kinetic ambayo imetumika hapo awali kutathmini mwingiliano kati ya IZUMO1 na JUNO.Baada ya incubation ya sensor biotin-labeled na IZUMO1 kama chambo na ukolezi juu ya JUNO analyte, ishara ya nguvu iligunduliwa (Mtini. S14a), kuonyesha mabadiliko ya kisheria-ikiwa katika unene wa biomaterial masharti ya ncha sensor.Ishara zinazofanana (yaani, JUNO iliyounganishwa na kihisi kama chambo dhidi ya uchanganuzi wa IZUMO1) (Mchoro S14b).Hakuna mawimbi yaliyogunduliwa wakati SPCA6 ilipotumiwa kama uchanganuzi dhidi ya IZUMO1 yenye kihisi au JUNO inayofunga kihisi (Mchoro S14a,b).Kutokuwepo kwa ishara hii kunaonyesha kuwa kikoa cha ziada cha SPCA6 hakiingiliani na kikoa cha ziada cha IZUMO1 au JUNO.
Kwa sababu upimaji wa BLI unatokana na uchanganyaji wa mabaki ya lisini bila malipo kwenye protini ya chambo, urekebishaji huu unaweza kuzuia kufunga ikiwa mabaki ya lisini yatahusika katika mwingiliano.Kwa kuongeza, mwelekeo wa jamaa ya kumfunga kwa sensor unaweza kuunda vikwazo vya steric, hivyo majaribio ya kawaida ya kuvuta chini pia yalifanywa kwenye recombinant SPCA6, IZUMO1 na ectodomains ya JUNO.Licha ya hayo, SPCA6 haikushuka kwa IZUMO1 yenye lebo Yake au JUNO yenye lebo Yake (Kielelezo S14c, d), ikionyesha hakuna mwingiliano unaolingana na ule ulioonekana katika majaribio ya BLI.Kama udhibiti mzuri, tulithibitisha mwingiliano wa JUNO wenye lebo yake IZUMO1 (Takwimu S14e na S15).
Licha ya mfanano wa kimuundo kati ya SPCA6 na IZUMO1, kutokuwa na uwezo wa SPCA6 kumfunga JUNO haishangazi.Uso wa IZUMO1 ya binadamu una mabaki zaidi ya 20 ambayo yanaingiliana na JUNO, ikiwa ni pamoja na mabaki kutoka kwa kila kanda tatu (ingawa nyingi ziko katika eneo la bawaba) (Mchoro S14f).Kati ya mabaki haya, moja tu ndiyo imehifadhiwa katika SPCA6 (Glu70).Ingawa mabaki mengi yalihifadhi sifa zao za asili za kibayolojia, mabaki muhimu ya Arg160 katika IZUMO1 yalibadilishwa na Asp148 yenye chaji hasi katika SPCA6;tafiti za awali zimeonyesha kuwa mabadiliko ya Arg160Glu katika IZUMO1 karibu kukomesha kabisa kumfunga JUNO43.Kwa kuongezea, tofauti ya mwelekeo wa kikoa kati ya IZUMO1 na SPCA6 iliongeza kwa kiasi kikubwa eneo la tovuti ya JUNO-binding ya eneo sawa kwenye SPCA6 (Mchoro S14g).
Licha ya hitaji linalojulikana la SPCA6 la muunganisho wa gamete na kufanana kwake na IZUMO1, SPCA6 haionekani kuwa na chaguo la kukokotoa la kuunganisha la JUNO.Kwa hivyo, tumejaribu kuchanganya data yetu ya muundo na ushahidi wa umuhimu unaotolewa na biolojia ya mabadiliko.Mpangilio wa mfuatano wa homologue za SPCA6 unaonyesha uhifadhi wa muundo wa kawaida zaidi ya mamalia.Kwa mfano, mabaki ya cysteine ​​​​yapo hata katika amfibia inayohusiana kwa mbali (Mchoro 6a).Kwa kutumia seva ya ConSurf, data nyingi za uwekaji wa mpangilio wa mfuatano wa mifuatano 66 zilichorwa kwenye uso wa SPCA6.Aina hii ya uchanganuzi inaweza kuonyesha ni masalia yapi yamehifadhiwa wakati wa mageuzi ya protini na inaweza kuonyesha ni sehemu gani za uso zina jukumu katika utendakazi.
mpangilio wa mfuatano wa ectodomain za SPCA6 kutoka kwa spishi 12 tofauti zilizotayarishwa kwa kutumia CLUSTAL OMEGA.Kulingana na uchanganuzi wa ConSurf, nafasi za kihafidhina zaidi zimewekwa alama ya bluu.Mabaki ya cysteine ​​yameangaziwa kwa rangi nyekundu.Mipaka ya kikoa na vipengele vya muundo wa pili huonyeshwa juu ya upangaji, ambapo mishale inaonyesha β-strands na mawimbi yanaonyesha helices.Vitambulisho vya Ufikiaji vya NCBI vilivyo na mfuatano ni: binadamu (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), tumbili wa capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), farasi (Equus 1002 or cabaci3) 23 XP_032_034) .), kondoo (Ovis aries, XP_014955560), tembo (Loxodonta africana, XP_010585293), mbwa (Canis lupus familyis, XP_025277208), panya (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian africana, XP_XP, XP_Plarisi3, XP_Plarisi, XP_Plarisi, XP_Plarisi3 , 8) , 61_89 na Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Kuhesabu kunategemea mpangilio wa kibinadamu.b Uwakilishi wa uso wa muundo wa SPCA6 wenye 4HB juu na kikoa kinachofanana na Ig chini, rangi kulingana na makadirio ya uhifadhi kutoka kwa seva ya ConSurf.Sehemu zilizohifadhiwa bora ziko katika rangi ya bluu, sehemu zilizohifadhiwa kwa wastani ziko nyeupe, na zilizohifadhiwa kidogo ni za njano.cysteine ​​ya zambarau.Vipande vitatu vya uso vinavyoonyesha kiwango cha juu cha ulinzi vinaonyeshwa katika sehemu iliyoandikwa viraka 1, 2 na 3. Katuni ya 4HB inaonyeshwa kwenye sehemu iliyo juu kulia (mpango wa rangi sawa).
Muundo wa SPCA6 una maeneo matatu ya uso yaliyohifadhiwa sana (Mchoro 6b).Kipande cha 1 kinachukua 4HB na eneo la bawaba na kina madaraja mawili ya disulfidi ya CXXC yaliyohifadhiwa, mtandao wa bawaba wa Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Mchoro S7), na mabaki matatu ya nje ya kunukia yaliyohifadhiwa (Phe31, Tyr73, Phe137).mdomo mpana wa kikoa cha Ig-kama (Mchoro S6e), ambayo inawakilisha mabaki kadhaa yenye chaji kwenye uso wa manii.Jambo la kushangaza ni kwamba kiraka hiki kina epitopu ya kingamwili ambayo hapo awali imeonyeshwa kuingilia utendaji wa SPCA6 30.Mkoa wa 3 unazunguka bawaba na upande mmoja wa kikoa kama Ig;eneo hili lina prolini zilizohifadhiwa (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) na mabaki ya polar/chaji yanayotazama nje.Kwa kushangaza, mabaki mengi kwenye uso wa 4HB yanabadilika sana (Kielelezo 6b), ingawa zizi huhifadhiwa katika homologue ya SPCA6 (kama inavyoonyeshwa na uhifadhi wa msingi wa hydrophobic bundle) na zaidi ya familia kuu ya IST.
Ingawa hili ndilo eneo dogo zaidi katika SPCA6 lenye vipengele vichache vya muundo wa upili vinavyoweza kutambulika, mabaki mengi ya kanda ya bawaba (pamoja na eneo la 3) yamehifadhiwa sana miongoni mwa homologue za SPCA6, ambayo inaweza kuashiria kwamba uelekeo wa kifungu cha helical na β-sandwich una jukumu.kama kihafidhina.Hata hivyo, licha ya uunganishaji mwingi wa hidrojeni na mitandao ya kielektroniki katika eneo la bawaba la SPCA6 na IZUMO1, ushahidi wa kunyumbulika wa ndani unaweza kuonekana katika upangaji wa miundo mingi inayoruhusiwa ya IZUMO137,43,44.Mpangilio wa vikoa vya kibinafsi ulipishana vyema, lakini mwelekeo wa vikoa kuhusiana na kila mmoja ulitofautiana kutoka 50 ° hadi 70 ° kutoka kwa mhimili wa kati (Mchoro S16).Ili kuelewa mienendo ya conformational ya SPCA6 katika suluhisho, majaribio ya SAXS yalifanywa (Mchoro S17a, b).Uundaji upya wa ectodomain ya SPCA6 ulilingana na muundo wa kioo wa fimbo (Mchoro S18), ingawa njama ya Kratky ilionyesha kiwango fulani cha kunyumbulika (Mchoro S17b).Muundo huu unatofautiana na IZUMO1, ambamo protini isiyofungwa huchukua umbo la boomerang katika kimiani na katika myeyusho43.
Ili kutambua hasa eneo linaloweza kunyumbulika, uchunguzi wa wingi wa kubadilishana hidrojeni-deuterium (H-DXMS) ulifanyika kwenye SPCA6 na ikilinganishwa na data iliyopatikana hapo awali kwenye IZUMO143 (Mchoro 7a, b).SPCA6 ni rahisi kunyumbulika zaidi kuliko IZUMO1, kama inavyoonyeshwa na ubadilishaji wa juu wa deuterium katika muundo wote baada ya s 100,000 za kubadilishana.Katika miundo yote miwili, sehemu ya C-terminal ya eneo la bawaba inaonyesha kiwango cha juu cha ubadilishaji, ambayo pengine inaruhusu mzunguko mdogo wa 4HB na vikoa vinavyofanana na Ig vinavyohusiana.Inashangaza, sehemu ya C-terminal ya bawaba ya SPCA6, inayojumuisha mabaki ya 147CDLPLDCP154, ni eneo lililohifadhiwa sana 3 (Mchoro 6b), ikiwezekana kuonyesha kwamba kubadilika kwa interdomain ni kipengele kilichohifadhiwa kwa mageuzi cha SPCA6.Kwa mujibu wa uchanganuzi wa kubadilika, data ya mafuta ya CD ya kuyeyuka ilionyesha kuwa SPCA6 (Tm = 51.2 ° C) ni chini ya utulivu kuliko IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Mchoro S1e na S19).
a H-DXMS picha za SPCA6 na b IZUMO1.Asilimia ya ubadilishanaji wa deuterium ilibainishwa katika muda uliobainishwa.Viwango vya kubadilishana hidrojeni-deuterium vinaonyeshwa kwa rangi kwenye kiwango cha gradient kutoka bluu (10%) hadi nyekundu (90%).Sanduku nyeusi zinawakilisha maeneo ya ubadilishanaji wa juu.Mipaka ya 4HB, bawaba na kikoa kama cha Ig kinachozingatiwa katika muundo wa fuwele huonyeshwa juu ya mlolongo wa msingi.Viwango vya ubadilishaji wa Deuterium katika s 10, 1000, na 100,000 s vilipangwa kwenye chati ya mstari iliyowekwa juu ya nyuso za molekuli za uwazi za SPCA6 na IZUMO1.Sehemu za miundo yenye kiwango cha ubadilishaji wa deuterium chini ya 50% ni rangi nyeupe.Maeneo yaliyo juu ya 50% ya ubadilishaji wa H-DXMS yamepakwa rangi katika kipimo cha gradient.
Matumizi ya CRISPR/Cas9 na mikakati ya kimaumbile ya jeni ya panya imesababisha kutambuliwa kwa mambo kadhaa muhimu kwa manii na kuunganisha na kuunganisha yai.Kando na mwingiliano wenye sifa nzuri wa muundo wa IZUMO1-JUNO na CD9, protini nyingi zinazohusiana na muunganisho wa gamete hubakia kuwa na fumbo kimuundo na kiutendaji.Sifa za kibiofizikia na kimuundo za SPCA6 ni kipande kingine cha mafumbo ya kujinata/muunganisho wa molekuli wakati wa kurutubisha.
SPCA6 na washiriki wengine wa familia kuu ya IST wanaonekana kuhifadhiwa sana katika mamalia na vile vile ndege mmoja mmoja, reptilia na amfibia;kwa kweli, inadhaniwa kuwa SPCA6 inahitajika hata kwa ajili ya kurutubishwa kwa zebrafish 59. Usambazaji huu ni sawa na protini nyingine zinazojulikana za gamete zinazohusiana na muunganisho kama vile DCST134, DCST234, FIMP31, na SOF132, na kupendekeza kuwa vipengele hivi vina upungufu wa HAP2 (pia. inayojulikana kama GCS1) protini ambazo huwajibika kwa shughuli ya kichocheo ya waandamanaji wengi., mimea, na arthropods.Protini za muunganisho zilizorutubishwa 60, 61. Licha ya ulinganifu mkubwa wa kimuundo kati ya SPCA6 na IZUMO1, uondoaji wa jeni unaosimba mojawapo ya protini hizi ulisababisha utasa kwa panya dume, ikionyesha kwamba kazi zao katika muunganisho wa gamete hazijarudiwa..Kwa upana zaidi, hakuna protini yoyote inayojulikana ya manii inayohitajika kwa awamu ya kushikamana ya muunganisho ambayo haina maana.
Swali linasalia kuwa swali wazi ikiwa SPCA6 (na washiriki wengine wa familia kuu ya IST) wanashiriki katika miunganisho ya michezo, kuunda mitandao ya intragametic ili kukusanya protini muhimu kwa sehemu za muunganisho, au labda hata kufanya kazi kama fusojeni ambazo hazipatikani.Masomo ya uimarishaji wa kinga ya mwili katika seli za HEK293T yalifichua mwingiliano kati ya urefu kamili wa IZUMO1 na SPCA632.Walakini, ectodomain zetu zilizojumuishwa hazikuingiliana katika vitro, na kupendekeza kuwa mwingiliano unaoonekana katika Noda et al.zote mbili zilifutwa katika ujenzi (kumbuka mkia wa cytoplasmic wa IZUMO1, ambao umeonyeshwa kuwa sio lazima kwa mbolea62).Vinginevyo, IZUMO1 na/au SPCA6 inaweza kuhitaji mazingira mahususi ya kumfunga ambayo hatuzalishi tena katika vitro, kama vile miunganisho mahususi ya kisaikolojia au changamano za molekuli zilizo na protini nyingine (zinazojulikana au ambazo bado hazijagunduliwa).Ingawa ectodomain ya IZUMO1 inaaminika kupatanisha ushikamano wa manii kwenye yai katika nafasi ya perivitelline, madhumuni ya ectodomain ya SPCA6 hayako wazi.
Muundo wa SPCA6 unaonyesha nyuso kadhaa zilizohifadhiwa ambazo zinaweza kuhusika katika mwingiliano wa protini na protini.Sehemu iliyohifadhiwa ya eneo la bawaba iliyo karibu na motifu ya CXXC (iliyoteuliwa Kipande cha 1 hapo juu) ina mabaki kadhaa ya kunukia yanayotazama nje ambayo mara nyingi huhusishwa na mwingiliano wa haidrofobi na π-stacking kati ya biomolecules.Pande pana za kikoa cha Ig-kama (eneo la 2) huunda kijito chenye chaji chanya na Arg iliyohifadhiwa sana na mabaki Yake, na kingamwili dhidi ya eneo hili zimetumika hapo awali kuzuia muunganisho wa gamete 30 .Kingamwili hutambua epitopu ya mstari 212RIRPAQLTHRGTFS225, ambayo ina mabaki matatu kati ya sita ya arginine na His220 iliyohifadhiwa sana.Haijabainika kama hitilafu hiyo inatokana na kuziba kwa masalia haya maalum au eneo zima.Mahali pa pengo hili karibu na C-terminus ya β-sandwich inaonyesha mwingiliano wa cis na protini za manii za jirani, lakini sio na protini za oocyte.Zaidi ya hayo, uhifadhi wa tangle yenye utajiri wa proline inayoweza kunyumbulika sana (tovuti ya 3) ndani ya bawaba inaweza kuwa tovuti ya mwingiliano wa protini-protini au, zaidi, inaonyesha uhifadhi wa kunyumbulika kati ya vikoa viwili.Jinsia ni muhimu kwa jukumu lisilojulikana la SPCA6.mchanganyiko wa gametes.
SPCA6 ina sifa za protini za kuunganishwa kwa seli, ikiwa ni pamoja na Ig-kama β-sandwiches.Protini nyingi za wambiso (km, kadherin, integrins, adhesini, na IZUMO1) zina kikoa kimoja au zaidi cha β-sandwich ambacho hupanua protini kutoka kwa membrane ya seli hadi malengo yao ya mazingira63,64,65.Kikoa kinachofanana na Ig cha SPCA6 pia kina motifu inayopatikana kwa kawaida katika sandwichi β za kushikana na mshikamano: sehemu mbili za nyuzi sambamba kwenye ncha za β-sandwichi, inayojulikana kama clamps za mitambo66.Inaaminika kuwa motif hii huongeza upinzani dhidi ya nguvu za shear, ambayo ni muhimu kwa protini zinazohusika katika mwingiliano wa intercellular.Hata hivyo, licha ya kufanana huku kwa adhesin, kwa sasa hakuna ushahidi kwamba SPCA6 inaingiliana na wazungu wa yai.Ektodomain ya SPCA6 haiwezi kushikamana na JUNO, na seli za HEK293T zinazoonyesha SPCA6, kama inavyoonyeshwa hapa, ni vigumu kuingiliana na oocyte zisizo na zone 32 .Iwapo SPCA6 itaanzisha vifungo kati ya michezo, mwingiliano huu unaweza kuhitaji marekebisho ya baada ya tafsiri au uimarishaji na protini nyingine za manii.Kwa kuunga mkono dhana ya mwisho, spermatozoa yenye upungufu wa IZUMO1 hufunga kwa oocytes, kuonyesha kwamba molekuli nyingine isipokuwa IZUMO1 zinahusika katika hatua ya 27 ya kuunganishwa kwa gamete.
Protini nyingi za virusi, seli, na maendeleo zina sifa zinazotabiri kazi yao kama fusojeni.Kwa mfano, glycoproteins ya mchanganyiko wa virusi (madarasa ya I, II na III) yana peptidi ya fusion ya hydrophobic au kitanzi mwishoni mwa protini ambayo imeingizwa kwenye membrane ya jeshi.Ramani ya haidrofilisi ya IZUMO143 na muundo (uliobainishwa na kutabiriwa) wa familia ya juu ya IST haukuonyesha peptidi ya muunganisho wa haidrofobu.Kwa hivyo, ikiwa protini zozote katika familia kuu ya IST hufanya kazi kama fusojeni, hufanya hivyo kwa njia tofauti na mifano mingine inayojulikana.
Kwa kumalizia, kazi za washiriki wa familia kuu ya IST ya protini zinazohusiana na muunganisho wa gamete bado ni fumbo la kustaajabisha.Molekuli yetu ya upatanishi ya SPCA6 na muundo wake uliotatuliwa utatoa maarifa kuhusu uhusiano kati ya miundo hii iliyoshirikiwa na jukumu lake katika viambatisho na muunganisho wa gameti.
Mfuatano wa DNA unaolingana na ectodomain ya binadamu ya SPCA6 iliyotabiriwa (nambari ya kujiunga ya NCBI NP_001303901.1; mabaki 27–246) iliboreshwa kwa kodoni ili kujieleza katika seli za Drosophila melanogaster S2 na kuunganishwa kama kipande cha jeni kwa mfuatano wa usimbaji wa Geknofi Koza)., mawimbi ya uteaji wa BiP na miisho ya 5′ na 3′ inayolingana ya uunganishaji unaojitegemea wa jeni hili kuwa vekta ya kujieleza ya pMT kulingana na kikuzaji cha metallothionein kilichorekebishwa kwa uteuzi kwa puromycin (pMT-puro).Vekta ya pMT-puro husimba tovuti ya mpasuko wa thrombin ikifuatiwa na lebo ya C-terminal ya 10x (Kielelezo S2).
Uhamishaji thabiti wa vekta ya SPCA6 pMT-puro hadi seli za D. melanogaster S2 (Gibco) ulitekelezwa sawa na itifaki iliyotumiwa kwa IZUMO1 na JUNO43.Seli za S2 ziliyeyushwa na kukuzwa katika kati ya Schneider (Gibco) zikisaidiwa na mkusanyiko wa mwisho wa 10% (v/v) seramu ya ndama ya fetasi iliyozimwa na joto (Gibco) na antibiotic 1X ya antimycotic (Gibco).Seli za kupitisha mapema (seli 3.0 x 106) ziliwekwa kwenye visima vya kibinafsi vya sahani 6 za visima (Corning).Baada ya saa 24 za incubation katika 27°C, seli zilihamishwa kwa mchanganyiko wa miligramu 2 za vekta ya SPCA6 pMT-puro na kitendanishi cha uhamishaji cha Effectene (Qiagen) kulingana na itifaki ya mtengenezaji.Seli zilizoambukizwa ziliangaziwa kwa saa 72 na kisha kuvunwa kwa puromycin 6 mg/ml.Kisha seli zilitengwa kutoka kwa kati kamili ya Schneider na kuwekwa kwenye serum isiyo na wadudu-XPRESS medium (Lonza) kwa ajili ya uzalishaji wa protini kwa kiwango kikubwa.Kundi la lita 1 la utamaduni wa seli za S2 lilikuzwa hadi seli 8-10 × 106 ml-1 katika chupa ya Erlenmeyer yenye uingizaji hewa wa lita 2 na kisha kuchujwa na mkusanyiko wa mwisho wa 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) na kuchujwa.kushawishiwa.Tamaduni zilizosababishwa ziliingizwa kwenye 27 ° C. saa 120 rpm kwa siku nne.
Kitanda kilicho na kiyoyozi kilicho na SPCA6 kilitengwa kwa usaidizi wa kati kwa 5660×g kwa 4°C na kufuatiwa na mfumo wa kuchuja mtiririko wa tangential wa Centramate (Pall Corp) wenye utando wa 10 kDa MWCO.Weka kati iliyokolezwa iliyo na SPCA6 kwenye safu wima ya 2 ml ya Ni-NTA agarose resin (Qiagen).Resini ya Ni-NTA ilioshwa na ujazo wa safu wima 10 (CV) ya bafa A na kisha CV 1 ya bafa A iliongezwa ili kutoa mkusanyiko wa mwisho wa imidazole wa 50 mm.SPCA6 ilitolewa kwa 10 ml ya bafa A iliyoongezwa imidazole hadi mkusanyiko wa mwisho wa 500 mm.Thrombin ya darasa la kizuizi (Millipore Sigma) iliongezwa moja kwa moja kwenye neli ya dayalisisi (MWCO 12-14 kDa) kwa kipimo cha 1 kwa mg SPCA6 dhidi ya 1 L 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 na 150 mM NaCl (bafa B) kwa dialysis.) kwa 4°C kwa masaa 48.SPCA6 iliyopasuka kwa thrombin kisha iliyeyushwa mara tatu ili kupunguza ukolezi wa chumvi na kupakiwa kwenye safu wima ya kubadilishana mawasiliano ya 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) iliyosawazishwa na 10 mm Tris-HCl, pH 7.5.Kibadilisha sauti kilioshwa na 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, kisha SPCA6 ikatolewa kwa kipenyo laini kutoka 0 hadi 500 mm NaCl katika 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 kwa 25 OK.Baada ya kromatografia ya ubadilishanaji wa ayoni, SPCA6 ilikolezwa hadi ml 1 na kuondolewa kiisokrasia kutoka kwa safu wima ya ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) iliyosawazishwa na bafa B. Kulingana na kromatogramu, mkusanyiko na visehemu vilivyo na SPCA6.Usafi ulidhibitiwa na electrophoresis yenye rangi ya Coomassie kwenye gel ya 16% ya SDS-polyacrylamide.Mkusanyiko wa protini ulihesabiwa kwa kunyonya kwa nm 280 kwa kutumia sheria ya Beer-Lambert na mgawo wa kinadharia wa kutoweka kwa molar.
SPCA6 iliyosafishwa ilichambuliwa usiku mmoja dhidi ya phosphate ya sodiamu ya 10 mM, pH 7.4 na 150 mM NaF na kupunguzwa hadi 0.16 mg/mL kabla ya uchanganuzi kwa uchunguzi wa CD.Skanning ya Spectral ya CD yenye urefu wa 185 hadi 260 nm ilikusanywa kwenye spectropolarimeter ya Jasco J-1500 kwa kutumia cuvettes ya quartz yenye urefu wa njia ya macho ya 1 mm (Helma) saa 25 ° C kwa kiwango cha 50 nm / min.Mwonekano wa CD ulisahihishwa, ukapata wastani wa zaidi ya 10, na kubadilishwa kuwa maana ya duaradufu iliyobaki (θMRE) katika digrii cm2/dmol:
ambapo MW ni uzito wa molekuli ya kila sampuli katika Da;N ni idadi ya amino asidi;θ ni umbile la duara katika millidegrees;d inalingana na urefu wa njia ya macho katika cm;mkusanyiko wa protini katika vitengo.