310 10*1mm Kipengele cha kemikali cha mirija ya chuma cha pua iliyojikunja ,Vikoa vya N-terminal vya spidroin huunda haidrojeli kulingana na nyuzi za amiloidi na hutoa jukwaa la uzuiaji wa protini.

Asante kwa kutembelea Nature.com.Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Vitelezi vinavyoonyesha makala tatu kwa kila slaidi.Tumia vitufe vya nyuma na vinavyofuata ili kusogeza kwenye slaidi, au vitufe vya kidhibiti cha slaidi mwishoni ili kusogea kwenye kila slaidi.

Vipimo

310 10*1mm wasambazaji wa mabomba ya chuma cha pua

Muundo wa Kemikali

Sifa za Mitambo

Protini za hariri ya buibui (protini za hariri ya buibui) zina matumizi mengi yanayoweza kutumika katika uundaji wa nyenzo mpya za kibaolojia, lakini asili yao ya aina nyingi na ya kujumlisha huzifanya kuwa ngumu kupatikana na rahisi kutumia.Hapa tunaripoti kwamba protini ndogo za spidroini zinazoweza kuunganishwa na, muhimu zaidi, kikoa cha N-terminal (NT) chenyewe hutengeneza hidrojeni zinazojitegemea na uwazi kwa 37 °C.protini za fusion zinazojumuisha NT na protini ya kijani ya fluorescent au purine nucleoside phosphorylase huunda protini za muunganisho zinazofanya kazi kikamilifu.Hidrojeni.Matokeo yetu yanaonyesha kuwa NT recombinant na proteni za muunganisho hutoa mavuno ya hali ya juu na huweka haidrojeli na sifa za kuvutia kama vile uwazi, ujichanganyaji bila kuunganishwa, na uzuiaji wa moja kwa moja wa protini hai katika msongamano wa juu.
Buibui wana seti saba tofauti za tezi za hariri, kila moja ikitokeza aina hususa ya hariri.Spishi zote saba za hariri zinaundwa na protini za hariri ya buibui (spidroins) takriban mabaki 6000 kwa urefu na zina eneo kubwa la kati linalorudiwa lililozungukwa na vikoa vya N- na C-terminal (NT na CT)1,2.Aina iliyosomwa zaidi ya hariri, ampula ya msingi, hutolewa na tezi ya msingi ya ampula.Katika tezi hii, seli moja ya seli za epithelial huunganisha protini za spidroini na kuziweka kwenye lumen ya tezi, ambapo ziko katika umbo la mumunyifu (doping) katika viwango vya juu sana (30-50% w/v)3,4.Mpangilio na muundo wa protini kuu za ampula spidroin katika tezi zimejadiliwa, lakini ushahidi mwingi wa majaribio unaonyesha uwepo wa muundo wa helical na/au nasibu na miundo ya micellar au lamela5,6,7,8,9,10.Ingawa vikoa vinavyorudiwa hudhibiti sifa za mitambo za nyuzi za hariri, na kutengeneza nanocrystals za karatasi ya β na miundo ya amofasi11,12,13,14,15, vikoa vya mwisho hudhibiti nyuzi za hariri kwa kukabiliana na mabadiliko ya hali kwenye tezi ya hariri16,17,18.Kwa kudhibiti uundaji wa hariri, 19. Vikoa vya vituo vinahifadhiwa kwa mageuzi na kazi yao inaweza kuwa ya kawaida kwa protini zote za spidroin 2,20,21.Wakati wa kupita kwenye tezi, pH ya spidroin hupungua kutoka takriban 7.6 hadi <5.716 na huongezeka kwa kunyoa na kunyoosha kunapopatanishwa na harakati kupitia mfereji unaopungua polepole.Katika suluhisho, CT ni α-helical constitutive sambamba dimer17, lakini kwa kukabiliana na pH ya chini na nguvu za kukata, CT inafunua na swichi β-tabaka16, 17, ikiwezekana kuchochea tabaka β katika maeneo yanayojirudia ya Convert 16. NT ni monomeri chini ya hali zinazoakisi hali katika lumen ya tezi na kupatanisha umumunyifu wa spidroin, lakini kwa pH iliyopunguzwa, upanuzi wa minyororo ya upande wa asidi ya kaboksili husababisha kupunguzwa kwa NT na pKa ya takriban 6.5, na hivyo kuleta utulivu wa NT na kurekebisha spidroin kwa kiasi kikubwa. kiasi.mitandao16,18.Kwa hivyo, NT ina jukumu muhimu katika malezi ya filamenti, kubadilisha kutoka kwa monoma katika mipako hadi dimer katika fiber23,24,25.NT inasalia kuwa na mumunyifu sana na helical chini ya hali zote zilizosomwa hadi tarehe16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ambayo ilihamasisha maendeleo yake kama lebo ya kuimarisha umumunyifu kwa ajili ya uzalishaji wa protini za heterologous.
Protini ndogo ya hariri ya buibui, inayojumuisha NT moja, eneo fupi la kurudia, CT moja, na lebo ya His6 (His-NT2RepCT) kwa ajili ya utakaso, huyeyushwa katika buffer yenye maji kama protini ya asili ya hariri ya buibui na inaiga sifa muhimu za asili za buibui wa hariri. .chanjo 25.31.His-NT2RepCT inaweza kusokota kuwa nyuzi mfululizo kwa kutumia mashine ya kibiomimetiki ambapo mipako yenye mumunyifu ya pH 8 hutolewa kwenye umwagaji wa maji wa pH 525,32,33,34,35.Uchachushaji wa kibaolojia wa E. koli unaoonyesha His-NT2RepCT na matibabu yaliyofuata baada ya matibabu ulisababisha mavuno ya >14 g/L baada ya kusafishwa.Mavuno ya juu, umumunyifu wa juu, na mwitikio wa kutosha wa His-NT2RepCT kwa hali ya tindikali yote yanahusishwa na NT23, 25, 34.
Hapa tunaripoti uundaji wa haraka wa haidrojeli za uwazi kutoka kwa protini za spidroini zinazojumuisha, pamoja na NT pekee, kwa kuangazia mmumunyo wa protini katika 37 °C.Kwa kutumia thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier kubadilisha infrared spectroscopy (FTIR), spectroscopy ya nyuklia resonance resonance (NMR) na transmission electron microscopy (TEM), tuligundua kuwa NT na microspider protini hupitia mabadiliko ya kimuundo kuwa β-sheets na nyuzinyuzi kama amiloidi. wakati gels zinaundwa.Kwa kuongeza, protini za muunganisho wa NT na protini ya kijani ya fluorescent (GFP) au purine nucleoside phosphorylase (PNP) huunda hidrojeni na vipande vya mchanganyiko vinavyofanya kazi kikamilifu.Kujieleza kwa matokeo ya juu katika majeshi ya heterologous, pamoja na uundaji wa haraka wa hidrojeni chini ya hali ya kisaikolojia, hufungua uwezekano wa uzalishaji wa gharama nafuu wa hidrojeni na kazi za uhandisi.
Tofauti na protini nyingi za spidroin36 zilizoripotiwa, His-NT2RepCT ni thabiti katika bafa ya Tris-HCl katika pH 8 na inaweza kujilimbikizia hadi 500 mg/mL bila mvua25.Kwa hiyo, tulishangaa kuona kwamba protini hii inaunda haraka hidrojeni za optically wazi, za kujitegemea wakati zinaingizwa kwenye 37 ° C (Mchoro 1b-d).Masomo zaidi yalionyesha kuwa yake-NT2RepCT gelation ilitokea juu ya mbalimbali ya viwango vya protini (10-300 mg/mL) na kwamba mkusanyiko huu mara inversely correlated na gelation muda (Mtini. 1c na Supplementary Mtini. 1).Ili kujua ni sehemu zipi za His-NT2RepCT hupatanisha uundaji wa hidrojeli, basi tulichunguza kila kikoa kibinafsi na katika michanganyiko mbalimbali kwa kutumia jaribio la ubadilishaji wa chupa (Mchoro 1a,b).Visehemu vyote vilivyojaribiwa vya spidroini ya recombinant vilitengeneza jeli (kwenye mkusanyiko wa protini wa 300 mg/mL) chini ya h 1, isipokuwa kwa 2Rep (Mchoro 1b).Hii inapendekeza kwamba NT na CT pekee, kwa kuchanganya, au kuhusishwa na kurudia, inaweza gel saa 37 ° C na kwamba tag His6 haiathiri mchakato huu kwa kiasi kikubwa.Kwa kuzingatia dhana ya kawaida kwamba NT ni protini yenye mumunyifu na thabiti, na kwamba ripoti za awali za hidrojeni za spidroin zinazoweza kuunganishwa zimehusisha athari za ujiaji na mabadiliko ya upatanishi katika maeneo yanayojirudia na/au CTs, NT yenyewe inaweza.Ugunduzi wa gelation haukutarajiwa.Jedwali la Nyongeza 1) 37, 38, 39. Kwa kushangaza, NT tayari imeundwa ndani ya dakika 10 kwenye mkusanyiko wa ≥ 300 mg/mL (Mchoro 1c).Majaribio ya ubadilishaji wa bakuli yenye viwango mbalimbali vya NT yalionyesha kuwa kwa > 50 mg/mL myeyusho wa NT ulitolewa kwa kasi zaidi kuliko His-NT2RepCT katika ukolezi unaolingana (w/v, Kielelezo 1c).
Uwakilishi wa kimkakati wa miundo mbalimbali ya spidroin iliyosomwa katika kazi hii.b Muda wa gel ifikapo 37 °C kwa protini mbalimbali za spidroini (300 mg/mL) zilizothibitishwa kwa kugeuza bakuli.Geli ya CT mara moja bila incubation (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm mizani).c Muda wa Gel wa His-NT2RepCT na NT katika viwango vya protini vilivyoonyeshwa katika 37°C.d Picha za hidrojeni za His-NT2RepCT na NT zenye buibui na herufi “NT” iliyochapishwa chini, mtawalia (zote 200 mg/mL, mizani 5 mm).
Hydrogels zinazoundwa na protini mbalimbali za spidroini zinazofanana zina rangi tofauti kidogo, na uchunguzi wa macho ya uchi unaonyesha viwango tofauti vya uwazi (Mchoro 1b).Geli za NT ziko wazi kwa njia ya kipekee ilhali geli zingine huwa opaque.Geli zake-NT2RepCT na NT zilizotupwa kwenye mirija ya silinda zinaweza kuondolewa kutoka kwenye ukungu usiobadilika (Mchoro 1d).
Ili kupima kama mipako ya asili ya hariri ya buibui katika hali ambayo sasa imepatikana kusababisha usagaji wa protini za spidroini zinazofanana, mipako ilikusanywa kutoka kwa tezi kubwa ya ampula ya buibui wa daraja la Uswidi (Larinioides sclopetarius).Mipako ilihifadhiwa katika bafa ya milimita 20 ya Tris-HCl kwa 50 mg/mL (kulingana na kipimo cha uzani kavu), lakini hakuna uekeshaji uliozingatiwa wakati wa uangushaji wa siku 21 kwa 37 °C (Mchoro wa Ziada 2a).
Ili kuhesabu gel hizi, vipimo vya rheological vinaweza kutumika kujifunza mchakato wa gelation na kuamua mali ya jumla ya mitambo.Hasa, ufuatiliaji wa moduli ya kuhifadhi (elasticity) kwa joto la juu inaweza kutoa taarifa juu ya joto la gelling pamoja na mali ya viscoelastic ya mipako.Majaribio ya kupanda kwa halijoto (kwa kutumia 1°C/dak ifikapo 25-45°C, kulingana na tafiti za awali kwa kutumia miyeyusho ya asili ya hariri)40,41 ilionyesha kuwa moduli za uhifadhi wa suluhu za His-NT2RepCT na NT ziliongezeka kwa kuongezeka kwa halijoto .iliongezeka (Mchoro 2 na Supplementary Fig. 3).Hasa, moduli ya NT ilianza kukua kwa joto la chini ikilinganishwa na His-NT2RepCT, kulingana na muda wa kasi wa gel uliozingatiwa wakati NT iliwekwa moja kwa moja na His-NT2RepCT saa 37 ° C (Mchoro 1).Baada ya kushuka kwa halijoto baadae, moduli ya uhifadhi haikurudi kwa viwango vya chini na ilibaki juu ya moduli ya upotezaji (tazama Mchoro wa 3 wa Nyongeza), ikionyesha ucheshi thabiti usioweza kutenduliwa.Baada ya kuyeyuka, moduli ya mwisho ya elastic ilianzia 15 hadi 330 kPa kwa hidrojeni za His-NT2RepCT katika mkusanyiko wa 100-500 mg/mL, na moduli ya mwisho ya elastic kwa hidrojeni NT (100-500 mg/mL) ilikuwa kati ya 2 hadi 1400. kPa (Mchoro , 2 na data kamili ya njia panda) angalia Kielelezo cha 3 cha Nyongeza).
a Mabadiliko ya halijoto wakati wa vipimo vya His-NT2RepCT (300 mg/mL) na b NT (300 mg/mL) kwa kutetemeka.Mishale inaonyesha mwenendo wa hali ya joto, na kivuli nyepesi cha data ya moduli ya uhifadhi inaonyesha majaribio kwa viwango vya chini vya torati ya chombo kuliko ilivyoainishwa na mtengenezaji, ambayo ndiyo sababu ya kelele kuongezeka.c Mkusanyiko wa moduli ya mwisho ya His-NT2RepCT na NT baada ya halijoto ya juu (100, 300, na 500 mg/mL).Usomaji wa moduli zote unachukuliwa kwa mzunguko wa 0.1 Hz.
Kama njia inayowezekana ya kuchunguza mabadiliko ya upatanishi yanayohusiana na uekeshaji, tulirekodi mwonekano wa FTIR wa His-NT2RepCT na NT kabla na baada ya kusaga kwa 37°C (Mchoro 3a,b).Kama ilivyotarajiwa, mwonekano wa masuluhisho ya His-NT2RepCT na NT yalilingana na protini zinazoonyesha muundo wa upili wa α-hesi/nasibu, na mkanda uliotamkwa wa 1645 cm-1.Kwa hidrojeni zote mbili, gelation ilisababisha kuundwa kwa silaha mbili katikati ya bendi ya katikati karibu 1617 cm-1 na 1695 cm-1 (Mchoro 3a, b), ikionyesha uundaji wa miundo ya karatasi ya β-antiparallel.Mabadiliko haya pia yanaweza kuonekana wazi katika derivative ya pili ya pili na tofauti gelation spectra (Supplementary Mtini. 4b).Mikanda miwili ya NT β-safu zilitamkwa zaidi kuliko zile za His-NT2RepCT, ikionyesha kwamba jumla ya maudhui ya bendi za safu-β katika hidrojeli ya NT yalikuwa ya juu kuliko yale ya hidrojeni ya NT2RepCT.
mwonekano wa ufyonzaji wa FTIR wa His-NT2RepCT na b NT (zote 500 mg/mL) kabla ya (suluhisho) na baada ya (gel) incubation katika 37°C.c picha za TEM za jeli za 50 mg/ml za NT2RepCT na d NT zilizosimamishwa tena.Kiwango cha bar 200 nm.e Vipenyo vya nyuzi za hidrojeni za His-NT2RepCT na NT.n = nyuzi 100 zilizopimwa, p <0.0001.Pau za makosa zinaonyesha kupotoka kwa kawaida.Katikati ya baa za makosa ndio maana.Jaribio la t lisilooanishwa ( lenye mikia miwili) lilitumika kwa uchanganuzi wa takwimu.f ThT fluorescence ya protini mbalimbali recombinant spidroini (100 mg/mL) ifikapo 37 °C bila kutetereka.g Majaribio ya chanjo ya NT (100 mg/mL) kutoka 100 mg/mL gel ya NT yenye 0%, 5%, 10%, na 20% ya mbegu.
Uchambuzi wa gel kwa kutumia microscopy ya elektroni ya maambukizi (TEM) ilionyesha kuwa hidrojeli ina nyuzi za amyloid-kama (Mchoro 3c, 3d).Fibrili zilizoundwa na NT zilirefushwa (kipenyo cha nm 5-12) na hazijatiwa matawi, wakati nyuzi za His-NT2RepCT zilikuwa fupi kwa urefu na kipenyo kikubwa zaidi (7-16 nm) (Mchoro 3e).Matokeo haya yalituwezesha kufuata kinetics ya fibrosis kwa kutumia thioflavin T (ThT) assay.Kwa protini zote za spidroini zinazofanana, ishara ya umeme iliongezeka wakati sampuli ziliwekwa kwenye 37 ° C (Kielelezo 3f, Kielelezo cha 5a).Sambamba na ugunduzi huu, uchunguzi wa hadubini wa NT na His-NT2RepCT chini ya hali ya gelling ulifunua ongezeko la usawa la fluorescence ya ThT bila mkusanyiko unaoonekana wa ndani wa mkusanyiko wa ThT-chanya (Mchoro wa Nyongeza 5b, c).Uundaji wa nyuzi za ThT-chanya haukufuatana na ongezeko la NT na turbidity Yake-NTCT (Mchoro wa ziada wa 5d), ambayo ina maana kwamba mtandao wa nyuzi katika gel unaweza kuunda bila kuacha uwazi wa gel.Kupanda mbegu kwa kuongeza kiasi kidogo cha nyuzi zilizoundwa awali kunaweza kuharakisha kwa kiasi kikubwa uundaji wa nyuzi za amiloidi42,43,44 lakini kuongeza 5%, 10% au 20% (w/w) NT kwenye suluhisho la hydrocoagulants ya NT.athari ya mbegu (Mchoro 3g).Labda hii ni kwa sababu ya ukweli kwamba nyuzi kwenye hydrogel ni za kudumu na haziwezi kutumika kama mbegu.
Tabia isiyotarajiwa ya protini za spidroini zinazoweza kuunganishwa katika viwango vya juu vya joto ilisababisha tafiti zaidi za uchunguzi wa sumaku ya sumaku ya nyuklia (NMR) ili kutambua mabadiliko yanayohusiana na uundaji wa jeli.Mwonekano wa NMR wa masuluhisho ya His-NT2RepCT yaliyorekodiwa kwa muda katika 37°C ulionyesha kuwa CT bado ilikuwa imekunjwa kwa kiasi, ilhali mawimbi ya NT na 2Rep yalikuwa yametoweka (Mchoro 4a), ikidokeza kwamba ilikuwa NT na 2Rep ambazo zilidhibiti uundaji wa His- Hidrojeni ya NT2RepCT.Ishara ya CT pia ilipunguzwa hadi 20% ya ukubwa wake wa asili, na kupendekeza kuwa CT pia imewekwa zaidi na kuingizwa katika muundo wa hidrojeni.Kwa sehemu ndogo ya CT, ambayo ni ya rununu kama ilivyo katika sampuli iliyowekwa awali na hivyo kuzingatiwa na suluhisho la NMR, taswira inakosa ishara kwa mabaki 10 ya kwanza yaliyoundwa, pengine kutokana na ugumu wa kutosogeza sehemu iliyoambatishwa ya His-NT2Rep .Mtazamo wa NMR wa -hali ya hidrojeni -NT2RepCT ulifunua uwepo mkuu wa α-heli na tabaka β na, kwa kiasi kidogo, upatanisho wa coil bila mpangilio (Mchoro 4b).Uchambuzi wa mabadiliko ya kemikali wa mabaki ya methionine yaliyopo katika NT pekee ulionyesha kuwa kikoa hiki kilikuwa kimegeuzwa kuwa muundo wa karatasi-β.Mtazamo unaotegemea wakati wa NT katika suluhisho ulionyesha kupungua kwa sare katika kiwango cha ishara (Mchoro 4c), na NMR ya hali ya imara ya hydrogels ya NT ilionyesha kuwa mabaki mengi ya NT yalibadilishwa kuwa miundo ya karatasi ya β (Mchoro 4d).Muundo wa 2Rep haukuweza kubainishwa tofauti kutokana na mwelekeo wake wa kujumlisha.Hata hivyo, hali dhabiti NMR spectra ya NTCT na His-NT2RepCT hidrojeni ilionekana sawa (Mchoro 4b; Supplementary Fig. 6b), na kupendekeza kuwa 2Rep imechangia kidogo kwa sehemu ya miundo ya His-NT2RepCT hidrojeni.Kwa hidrojeni za CT, α-heli, karatasi za β, na miundo ya sekondari ya helical isiyo ya kawaida ilipatikana kuwepo (Mchoro wa ziada wa 6d).Hii inapendekeza kwamba baadhi ya sehemu za CT husalia α-heli wakati nyingine kuwa β-laha.Kwa hivyo, matokeo ya taswira ya NMR yanaonyesha kuwa NT ni muhimu kwa uundaji wa haidrojeli na pia hubadilika kuwa muundo wa karatasi-β unapounganishwa na 2Rep na CT.Sambamba na hili, hivi majuzi tuligundua kuwa zipu za anga za amiloidi zinawezekana kuunda katika helisi zote tano za kikoa cha NT, na algorithm ya Waltz ilitabiri eneo la amyloidogenic katika hesi 1 (Mchoro 4e).
Mwonekano wa 2D wa 15N-HSQC 10 mg/mL Myeyusho wa His-NT2RepCT kabla ya (bluu) na saa 19 baada ya incubation (nyekundu) kwa 37°C.Vilele vya msalaba wa mtu binafsi katika wigo nyekundu na F24, G136, polyA katika wigo wa bluu huonyeshwa na alama za amino asidi ya herufi moja na nambari za mabaki.Vipengee vilivyowekwa vinaonyesha utegemezi wa ukubwa wa mawimbi kwa wakati kwa masalio yaliyochaguliwa kutoka kwa vikoa vya NT, 2Rep, na CT.b Mwonekano wa hali ya redio thabiti (RFDR) wa hidrojeni za His-NT2RepCT.Uwiano wa mabaki ya Cα/Cβ yaliyozingatiwa katika mwonekano wa RFDR yaliamuliwa kwa kulinganisha na mabadiliko ya kemikali ya peptidi ya mfano na maadili yanayotokana na takwimu82,83 na miundo yao ya pili.SSB - ukanda wa pembeni unaozunguka.c Mionzi yenye sura moja ya 15N-HSQC 10 mg/mL NT myeyusho wa incubation ifikapo 37 °C kwa saa 36.Kipengele cha kuingiza kinaonyesha ukubwa wa volumetric dhidi ya wakati.d Hali thabiti RFDR spectra ya hidrojeni NT.Uwiano wa mabaki ya Cα/Cβ na miundo yao ya upili inayozingatiwa katika mwonekano wa RFDR yanaonyeshwa.e Kulingana na wasifu wa mvuto wa NT45.79 kutoka kwa hifadhidata ya Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Nishati ya Rosetta ya dirisha la kuhama kwa umeme wa anga ya hexapeptidi inaonyeshwa katika kcal/mol.Pau nyekundu huashiria hexapeptidi zenye mvuto wa juu wa adilifu (nishati ya Rosetta chini ya -23 kcal/mol; chini ya mstari wa nukta).Pau za kijani zinaonyesha vipande vilivyo na nishati ya Rosetta juu ya kizingiti na kwa hivyo kuna uwezekano mdogo wa kuunda zipu mnene.Vipande vilivyo na proline viliondolewa kwenye uchanganuzi (bila safu wima).Mraba huonyesha maeneo ya amiloidosis yaliyotabiriwa na kanuni ya Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Msururu wa masalia ya asidi ya amino ya NT iko juu, na aina za masalia zinazopatikana katika muundo wa upili wa β (zinazoamuliwa na uchunguzi wa hali dhabiti wa NMR) zinaonyeshwa kwa rangi nyekundu.Nafasi za helikopta tano za NT zimeteuliwa kama (H1-H5)28.
Katika pH <6.5, HT hupungua, ikistahimili mchemko unaosababishwa na joto au urea18.Ili kufafanua jinsi dimerization na uthabiti wa NT huathiri uchanganyaji, miyeyusho iliyo na 100 mg/ml NT ilidhibitiwa kwa pH 8, 7, na 6 kwa kutumia jaribio la ubadilishaji wa viala.Sampuli za NT ziliwekwa kwenye pH 8 na 7 baada ya dakika 30 kwa 37 °C, lakini gel ya pH 8 ilibaki wazi, wakati jeli ya pH 7 ilionyesha mvua inayoonekana (Mchoro 5a).Kinyume chake, suluhu iliyo na HT katika pH 6 haikuunda gel, na mvua kubwa inaweza kuonekana baada ya dakika 20 kwa 37°C.Hii inapendekeza kwamba dimers zenyewe na/au uthabiti wao wa juu ikilinganishwa na monoma huzuia ucheaji.Uundaji wa mvua ya NT katika pH 7 na 6 haikutarajiwa, kwani imeripotiwa kuwa NT inaweza mumunyifu kwa 200 mg/ml27, hurudia kwa urahisi baada ya kubadilika kwa joto, na pia huhifadhi α-helix kwa viwango vya chini vya pH 18. Ufafanuzi unaowezekana wa hitilafu hizi ni kwamba majaribio yaliyoripotiwa hapo awali yalifanywa kwa halijoto ya kawaida au chini ya hapo, au kwa viwango vya chini vya protini16,18,19.
Kipimo cha ubadilishaji wa viala vya NT (100 mg/mL) kwa pH 8, 7, 6 na 154 mM NaCl (pH 8) baada ya kuangukiwa kwenye 37°C.b NT CD spectra yenye na bila 154 mM NaF na 154 mm NaCl, mtawalia.Mviringo wa Molar katika 222 nm hubadilishwa kuwa sehemu ya mikunjo ya asili.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C na 60 °C), NTA72R (37 °C), na His-NT-L6 (37 °C na 60 °C).d mwonekano wa CD wa NT mutants NT*, NTA72R, na His-NT-L6.Mviringo wa Molar katika 222 nm hubadilishwa kuwa sehemu ya mikunjo ya asili.e Jaribio la ubadilishaji wa NTFlSp, NTMiSp na NTMiSp iliyopunguzwa (100 mg/mL).Upau wa mizani 5 mm.f Mwonekano wa CD wa NT, NTFlSp, NTMiSp na NTMiSp iliyopunguzwa.Mviringo wa Molar katika 222 nm hubadilishwa kuwa sehemu ya mikunjo ya asili.Mwonekano kamili wa NT katika 25 °C na 95 °C unaonyeshwa kwenye Kielelezo cha 8 cha Nyongeza.
Mkusanyiko wa chumvi ya kisaikolojia huamua mwingiliano wa kielektroniki kati ya vitengo vidogo vya NT na dimerization ya uhamishaji wa NT hadi pH18 ya chini.Tuligundua kuwa uwepo wa 154 mM NaCl na NaF kwa hakika ulizuia uekeshaji, mtawalia (Kielelezo 5a, b; Kielelezo cha Nyongeza 2b) na kwamba chumvi hizi ziliongeza uthabiti wa joto wa monoma za NT (Mchoro 5b, Kielelezo cha 8 cha Nyongeza). .Pia inapendekeza kwamba kuimarisha utulivu, badala ya dimerization, kuzuia malezi ya gel.
Ili kuchunguza zaidi dhima ya upunguzaji mwanga wa protini na uthabiti katika uekeshaji, tulitumia mutants mbili, NT* na NTA72R, ambazo pia zinasalia kuwa monomeri katika pH28.30 ya chini.NT* ni kigeuzi cha kubadilisha chaji mara mbili ambapo usambazaji unaoonekana wa malipo ya dipolar ya monoma husawazishwa, ambayo huzuia dimerization na huongeza kwa kiasi kikubwa uthabiti wa monoma.NTA72R ni dipole inayochajiwa, lakini Ala inayobadilishwa na Arg iko kwenye mpaka wa dimer, kwa hivyo mabadiliko huingilia mwingiliano wa kitengo kidogo kinachohitajika ili kupunguza uzito.Juu ya incubation saa 37 ° C, NT * haikuunda hydrogel, wakati NTA72R iliunda gel opaque kwa dakika 15 (Mchoro 5c).Kwa kuwa NT* na NTA72R zote haziwezi kufifisha lakini zinatofautiana katika uthabiti wa monoma (Kielelezo 5d), matokeo haya yanapendekeza sana kuwa uthabiti wa hali ya juu wa halijoto huzuia NT kutoka kwenye gelling.Hii pia inaungwa mkono na ukweli kwamba HT * huunda gel wakati ni imara kwa joto la juu (baada ya dakika 8 saa 60 ° C; Mchoro 5c).Hapo awali imeonyeshwa kuwa maudhui ya juu ya methionine katika NT huyeyusha mkunjo wake wa asili na kwamba vibadala sita vya Met to Leu (vinarejelewa hapa kama His-NT-L6) hutawanisha kwa nguvu monoma ya NT46.Kulingana na dhana kwamba unyumbufu wa muundo unahitajika kwa uundaji wa jeli ya NT, tuligundua kuwa mutant thabiti ya His-NT-L6 haikuwa na gel ifikapo 37 °C (Mchoro 5c, d).Hata hivyo, His-NT-L6 pia iliunda gel juu ya incubation saa 60 ° С kwa dakika 60 (Mchoro 5c).
Uwezo wa NT kubadilika kuwa miundo ya karatasi-β na kuunda haidrojeni unaonekana kutumika kwa baadhi lakini si vikoa vyote vya NT vya spidroin.NT kutoka kwa aina tofauti za hariri na spishi za buibui, Trichonephila clavipes (NTFlSp), walitengeneza geli licha ya maudhui yao ya chini ya methionine na uthabiti wa hali ya juu wa joto (Mchoro 5e, f na Jedwali la Ziada 2).Kwa kulinganisha, NT kutoka kwa spidroin ndogo ya protini ya ampullar kutoka Araneus ventricosus (NTMiSp) yenye utulivu wa chini wa mafuta na maudhui ya juu ya methionine haikuunda hydrogels (Jedwali la ziada la 2 na Mchoro 5e, f).Mwisho unaweza kuhusishwa na kuwepo kwa vifungo vya intramolecular disulfide29,47.Kwa mara kwa mara, wakati vifungo vya disulfide vya NTMiSp vilipunguzwa, iliunda hydrogel baada ya incubation saa 37 ° C kwa dakika 10 (Mchoro 5e).Kwa kumalizia, ni lazima ieleweke kwamba kubadilika kwa muundo ni muhimu, lakini sio pekee, kigezo cha kuundwa kwa gel kutoka NT.Sababu nyingine ambayo inaweza kuwa muhimu ni mwelekeo wa kuunda nyuzi za amyloid, na uchambuzi na hifadhidata ya zipu na algoriti ya Waltz ilionyesha uhusiano kati ya uwezo wa kuunda geli na uwepo wa maeneo ya amyloidogenic, na vile vile kiwango cha maeneo yaliyotabiriwa. kuunda zipu za steric.Kulikuwa na uwiano (Jedwali la Nyongeza 2 na Kielelezo cha 9 cha Nyongeza).
Uwezo wa NT kuunda nyuzi na kuunda geli chini ya hali nzuri ulituongoza kudhani kuwa miunganisho ya NT na vipande vingine vya protini bado inaweza kuunda geli zenye utendaji kamili wa washirika wa muunganisho.Ili kupima hili, tulianzisha protini ya kijani ya fluorescent (GFP) na purine nucleoside phosphorylase (PNP) kwenye C-terminus ya NT, kwa mtiririko huo.Protini zilizotokana za muunganisho zilionyeshwa katika E. koli yenye mavuno mengi sana ya mwisho (150 mg/L na 256 mg/L tamaduni za chupa za kutikisa kwa His-NT-GFP na His-NT-PNP, mtawalia), kulingana na kile ambacho kimeonyeshwa. kwa protini zingine zilizounganishwa kwa NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) na His-NT-PNP (100mg/mL) ya protini za mchanganyiko ziliunda gel baada ya saa 2 na saa 6.5 saa 37 ° C na, muhimu, sehemu ya GFP ilibakia bila kubadilika.aliona baada ya kuchujwa, na> 70% ya kiwango cha awali cha fluorescence iliyobaki baada ya kuchuja (Mchoro 6a).Ili kupima shughuli za PNP katika suluhu na jeli zake-NT-PNP, ilitubidi kuzimua protini ya muunganisho na NT kwa sababu shughuli ya enzymatic ya utayarishaji safi ilikuwa nje ya anuwai ya utambuzi wa viwango vya gelling.Geli iliyotengenezwa kwa mchanganyiko ulio na 0.01 mg/mL His-NT-PNP na 100 mg/mL NT ilibakiza 65% ya shughuli ya awali ya enzymatic ya sampuli zilizowekwa awali (Mchoro 6b).Gel ilibakia intact wakati wa kipimo (Supplementary Fig. 10).
Kiwango cha upenyezaji wa umeme kabla na baada ya kuchujwa kwa His-NT-GFP (300 mg/mL) na bakuli iliyogeuzwa yenye hidrojeni ya His-NT-GFP (300 mg/mL) chini ya mwanga unaoonekana na wa UV.Pointi zinaonyesha vipimo vya mtu binafsi (n = 3), pau za makosa zinaonyesha kupotoka kwa kawaida.Thamani ya wastani inaonyeshwa katikati ya pau za makosa.b Shughuli ya PNP ilipatikana kwa uchanganuzi wa florometri kwa kutumia suluhu na jeli zinazojumuisha NT (100 mg/ml) na mchanganyiko ulio na 0.01 mg/ml his-NT-PNP na 100 mg/ml Dola mpya za Taiwan.Kipengele cha kuingiza kinaonyesha bakuli iliyogeuzwa iliyo na hidrojeni iliyo na His-NT-PNP (upau wa mizani 5).
Hapa, tunaripoti uundaji wa haidrojeni kutoka kwa NT na protini zingine za spidroini zinazoweza kuunganishwa kwa kuangazia mmumunyo wa protini katika 37°C (Mchoro 1).Tunaonyesha kwamba gelation inahusishwa na mabadiliko ya α-heli katika tabaka za β na uundaji wa nyuzi za amyloid-kama (Mchoro 3 na 4).Ugunduzi huu unashangaza kwani NTs ni vifurushi vya globulari vya helix tano vinavyojulikana kwa umumunyifu wa juu sana na uthabiti wa juu katika viwango vya >200 mg/mL kwa 4°C kwa siku kadhaa27.Kwa kuongeza, NT hujirudia kwa urahisi baada ya kubadilika kwa joto katika viwango vya chini vya protini katika µM.Kulingana na matokeo yetu, uundaji wa fibril unahitaji mchanganyiko wa> mkusanyiko wa protini 10 mg/mL na joto la juu kidogo (Mchoro 1).Hii inalingana na wazo kwamba nyuzi za amiloidi zinaweza kuunda kutoka kwa protini zilizokunjwa kiutandawazi ambazo ziko katika hali iliyofunuliwa kwa kiasi kutokana na mabadiliko ya joto chini ya hali ya kisaikolojia 48 .Mifano ya protini zinazopitia ubadilishaji huu ni pamoja na insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin na lysozyme51,52,53.Ingawa NT ni α-hesi katika hali yake ya asili, takriban 65% ya mnyororo wa polipeptidi inaoana na uundaji wa zipu steric (Mchoro 4e) 45 .Kwa kuwa monoma ina mwendo wa kasi46, inaweza kufichua maeneo haya yanayowezekana ya amyloidogenic katika viwango vya juu vya joto vya juu na katika viwango vya juu vya protini jumla inaweza kufikia mkusanyiko muhimu kwa malezi ya amiloidi fibril54.Kufuatia hoja hii, tulipata uwiano hasi kati ya ukolezi wa spidroin na wakati wa kuchuja (Mchoro 1c), na ikiwa muundo wa monomeri wa NT umetulia ama kwa mabadiliko (NT*, His-NT-L6) au kwa kuongeza chumvi, inaweza kuzuia hydrogels ya malezi (Mchoro 5).
Katika hali nyingi, nyuzi za amiloidi hupotea kutoka kwa suluhisho kama mvua, lakini chini ya hali fulani zinaweza kuunda hidrojeni 55,56,57.Fibrili zinazounda haidrojeni kwa kawaida huwa na uwiano wa hali ya juu na huunda mitandao thabiti ya pande tatu kupitia msokoto wa molekuli,55,58 kulingana na matokeo yetu.Kwa uundaji wa hydrogel katika vitro, protini mara nyingi hufunuliwa kikamilifu au kwa sehemu, kwa mfano, kwa kuathiriwa na vimumunyisho vya kikaboni, joto la juu (70-90 ° C) na / au pH ya chini (1.5-3.0) 59,60,61,62.Hidrojeni za spidroin zilizoelezwa hapa hazihitaji usindikaji mkali, wala hazihitaji mawakala wa kuunganisha msalaba ili kuleta utulivu wa hidrojeni.
Hapo awali imeripotiwa kuwa spidroin hurudia na QDs, ambazo zinaonekana kupitia ubadilishaji wa karatasi-β wakati wa kuzunguka kwa hariri, huunda haidrojeni.Ikilinganishwa na matokeo yetu, nyakati za incubation na/au halijoto ya incubation ilikuwa ndefu zaidi au juu zaidi, mtawalia, na hidrojeli zilizosababishwa mara nyingi hazikuwa wazi (Mchoro 7 na Jedwali la Nyongeza 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. Mbali na nyakati za haraka za gel, hidrojeli za NT>300 mg/mL (30%) zilifaulu kuliko haidrojeli zingine zote za protini za hariri ya buibui, pamoja na haidrojeni asilia kama vile gelatin, alginate (2%), agar (0.5 % ) na collagen.(0.6%) (Kielelezo 7 na Majedwali ya Nyongeza 1 na 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Muda wa gel na moduli elastic ya hidrojeni katika utafiti huu zililinganishwa na hidrojeni nyingine zenye msingi wa spidroin na hidrojeni asilia zilizochaguliwa.Marejeleo hutolewa pamoja na maelezo ya hali ya gelation.APS Ammonium sulfate, joto la kawaida.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Buibui wanaonekana kuwa na njia za kuzuia spidroin kutoka kwenye gelling wakati wa kuhifadhi.Licha ya mkusanyiko mkubwa wa protini katika tezi ya hariri, eneo kubwa la kurudia linalohusishwa na kikoa cha mwisho inamaanisha kuwa ukolezi unaoonekana wa NT na CT katika tezi inalingana na takriban 10-20 mg/ml, kwenye mpaka wa utafiti huu.inahitajika kwa ajili ya in vitro aliona malezi ya hydrogel.Aidha, viwango sawa ya chumvi 16 imetulia NT, kama katika tezi hariri (Mtini. 5b).Uunganisho wa NT umechunguzwa katika saitosol ya E. koli na kupatikana kuwa imekunjwa kwa nguvu zaidi kuliko inapochunguzwa katika vitro, ikionyesha zaidi kwamba chumvi au vipengele vingine huzuia kuunganishwa kwake katika vivo.Hata hivyo, uwezo wa NTs kubadilika kuwa nyuzi za karatasi-β unaweza kuwa muhimu kwa uundaji wa nyuzi na unapaswa kuchunguzwa katika masomo yajayo.
Mbali na vipengele vya riwaya vya NT-amiloidi-kama uundaji wa fibrili na haidrojeli iliyozingatiwa katika utafiti huu, pia tunaonyesha kuwa jambo hili linaweza kuwa na matumizi ya kibayoteknolojia na ya matibabu (Mchoro 8).Kama uthibitisho wa dhana, tuliunganisha NT na GFP au PNP na tukaonyesha kwamba protini ya muunganisho pia huunda haidrojeli inapoangaziwa hadi 37 °C na kwamba sehemu za GFP na PNP kwa kiasi kikubwa huhifadhi shughuli zao baada ya kusagwa (Mchoro 6).Nucleoside phosphorylases ni vichocheo muhimu usanisi wa nucleoside analogues75, ambayo hufanya ugunduzi wetu kuwa muhimu kwa tasnia ya dawa ya kibayolojia.Wazo la kuonyesha protini za muunganisho zinazounda haidrojeli zinazoonekana katika hali nzuri huruhusu uundaji wa hidrojeli zinazofanya kazi na sifa zinazofaa kwa matumizi anuwai kama vile uhamasishaji wa kimeng'enya, kutolewa kwa dawa kudhibitiwa na uhandisi wa tishu.Zaidi ya hayo, NT na NT* ni viashirio bora vya kujieleza30, ambayo ina maana kwamba NT na vibadala vyake vinaweza kutumika kwa ajili ya uzalishaji wa juu wa protini mumunyifu na kuunda protini lengwa zisizohamishika katika hidrojeni za 3D.
NT ni mumunyifu, α-helical na thabiti katika viwango vya chini (µM) na 37°C.Katika halijoto sawa, lakini kwa viwango vinavyoongezeka (>10 mg/ml), NT huunda geli zinazojumuisha nyuzi zinazofanana na amiloidi.Protini za muunganisho wa NT pia huunda jeli za fibrillar zilizo na vipande vya muunganisho vinavyofanya kazi kikamilifu, hivyo kuruhusu protini mbalimbali kutosonga katika hidrojeni za 3D kwa kutumia NT.Chini: NT (PDB: 4FBS) na vielelezo vya mitandao ya nyuzi na miundo inayohusishwa ya protini (inayodhaniwa na haijachorwa kwa kiwango, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2).
Miundo (tazama Jedwali la Ziada 4 kwa orodha kamili ikijumuisha mfuatano wa asidi ya amino) iliundwa katika plasmid pT7 na kubadilishwa kuwa E. koli BL21 (DE3).E. koli iliyo na plasmidi zilizobuniwa zilichanjwa kwenye mchuzi wa Luria ulioongezewa kanamycin (70 mg/l) na kukuzwa mara moja kwa 30°C na 250 rpm.Utamaduni huo kisha ulichanjwa 1/100 ndani ya LB kati iliyo na kanamycin na kukuzwa kwa 30 ° C na 110 rpm hadi OD600 kufikia 0.8.Kwa tafiti za NMR, bakteria walikuzwa katika M9 ya kati iliyo na 2 g ya D-glucose 13C (Aldrich) na 1 g ya kloridi ya ammoniamu 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) kwa kuweka lebo ya protini kwa isotopu.Punguza halijoto hadi nyuzi joto 20 na ushawishi mwonekano wa protini na isopropylthiogalactopyranoside ya 0.15 mm (mkusanyiko wa mwisho).Baada ya kujieleza kwa protini usiku kucha, seli zilivunwa kwa 7278×g, 4°C kwa dakika 20.Vidonge vya seli vilisimamishwa tena katika 20 mM Tris-HCl, pH 8, na kugandishwa hadi kutumika tena.Seli zilizoyeyushwa zilikatwa kwa kutumia kisumbufu cha seli (mashine za mfululizo wa TS, Constant Systems Limited, Uingereza) kwa 30 kPa.Kisha lysates ziliwekwa katikati kwa 25,000 g kwa dakika 30 kwa 4 ° C.Kwa NTMiSp, pellet ilisimamishwa tena katika 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, na sonicated kwa dakika 2 (2 s on/off, 65%), kisha centrifuged tena katika 25,000 xg, 4° C. ndani ya Dakika 30.Dawa ya juu ilipakiwa kwenye safu wima ya Ni-NTA, ikaoshwa kwa 20 mM Tris-HCl, imidazole 2 mm, pH 8, na hatimaye protini ikatolewa kwa 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Kuzalisha NT2RepCT na NTCT, usagaji wa thrombin huanzisha tovuti (ThrCleav) kati ya Yake na NT.Tovuti za Thrombin cleavage pia zipo katika His-NT-ThrCleav-2Rep (huzalisha 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (huzalisha NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (huzalisha CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (huzalisha NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (huzalisha NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (huzalisha NTF1Sp), na His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (huzalisha NTMiSp).Miundo iliyeyushwa kwa thrombin (1:1000) na kusafishwa usiku kucha kwa 4° C. kwa 20 mm Tris-HCl, pH 8, kwa kutumia utando wa dialysis wa Spectra/Por wenye kizingiti cha uzito wa molekuli cha 6-8 kDa.Baada ya dayalisisi, myeyusho hupakiwa kwenye safuwima ya Ni-NTA na maji taka yenye protini ya kuvutia hukusanywa.Viwango vya protini vilibainishwa kwa kupima ufyonzaji wa UV kwa nm 280 kwa kutumia mgawo wa kutoweka wa kila protini, isipokuwa NTF1Sp, ambayo ilitumia kipimo cha Bradford kulingana na itifaki ya mtengenezaji.Usafi iliamuliwa na SDS Polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis na Coomassie kipaji bluu Madoa.Protini zilikolezwa kwa kutumia vichungi vya centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) kwa 4000 xg na kukatwa kwa molekuli ya kDa 10 katika mizunguko ya dakika 20.
Kuyeyusha myeyusho wa protini na bomba 150 µl kwa uangalifu kwenye bakuli safi ya septamu ya 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Mirija ilifungwa na kufungwa kwa parafilm ili kuzuia uvukizi.Sampuli (n = 3) ziliwekwa kwenye 37°C au 60°C na mara kwa mara ziligeuzwa ili kuchunguza ueketaji.Sampuli ambazo hazikuwa na gel ziliwekwa kwa angalau wiki moja.Punguza vifungo vya disulfide vya NTMiSp kwa 10 mM DTT kwa kila protini 10 µM.Ili kuchanganua uchanganyaji wa mipako ya asili ya hariri ya buibui, buibui wa daraja la Uswidi ilikatwa, tezi kuu mbili zilizoinuliwa ziliwekwa katika 200 μl ya 20 mm Tris-HCl buffer pH 8 na kukatwa ili kuruhusu mipako kujitenga na tezi..Yaliyomo kwenye tezi huyeyushwa katika bafa, 50 µl kwa ajili ya kuamua uzito kavu (kwa incubation ya bakuli wazi katika 60 ° C hadi uzito wa mara kwa mara) na 150 µl kwa gel kwa 37 ° C.
Jiometri / chombo cha kupimia hufanywa kwa chuma cha pua kwa kutumia sahani sambamba na kipenyo cha juu cha 20 mm na pengo la 0.5 mm.Joto sampuli kutoka 25 °C hadi 45 °C na kurudi hadi 25 °C kwa kasi ya 1 °C kwa dakika kwa kutumia sahani ya chini ya chuma cha pua ya Peltier.Vipimo vya vibrational vilifanyika kwa mzunguko wa 0.1 Hz na katika eneo la mstari wa viscoelastic ya nyenzo kwa shida ya 5% na 0.5% kwa sampuli za 100 mg / mL na 300-500 mg / mL, kwa mtiririko huo.Tumia chemba maalum ya unyevu ili kuzuia uvukizi.Data ilichanganuliwa kwa kutumia Prism 9.
Kwa kukusanya spectra ya infrared (IR) kwenye joto la kawaida kutoka 800 hadi 3900 cm-1.Kifaa cha ATR, pamoja na njia ya mwanga kupitia spectrometer, husafishwa na hewa kavu iliyochujwa kabla na wakati wa jaribio.Suluhisho (500 mg/mL ili kupunguza vilele vya kunyonya maji kwenye spectra) ziliwekwa bomba kwenye fuwele, na geli (500 mg/mL) ziliundwa kabla ya kipimo na kisha kuhamishiwa kwenye fuwele (n = 3).Uchanganuzi 1000 ulirekodiwa kwa azimio la 2 cm-1 na mzunguko wa sifuri wa 2. Toleo la pili lilikokotolewa kwa kutumia OPUS (Bruker) kwa kutumia safu ya kulainisha ya pointi tisa.Mtazamo ulirekebishwa kwa eneo moja la ushirikiano kati ya 1720 na 1580 cm-1 kwa kutumia F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Katika spectroscopy ya ATR-IR, kina cha kupenya cha boriti ya infrared kwenye sampuli inategemea nambari ya mawimbi, na hivyo kusababisha kufyonzwa kwa nguvu kwa nambari za chini za mawimbi kuliko nambari za juu zaidi za mawimbi.Athari hizi hazijasahihishwa kwa spectra iliyoonyeshwa kwenye Mtini.3 kwa sababu ni ndogo sana (Supplementary Fig. 4).Mwonekano uliosahihishwa wa takwimu hii ulikokotolewa kwa kutumia programu ya Bruker OPUS.
Kimsingi, upimaji wa kina wa miunganisho ya protini unawezekana baada ya utengano wa kuaminika wa vipengele ndani ya kilele cha amide I.Hata hivyo, baadhi ya vikwazo hutokea katika mazoezi.Kelele katika wigo inaweza kuonekana kama kilele (cha uwongo) wakati wa utatuzi.Kwa kuongezea, kilele kinachotokana na kujipinda kwa maji kinapatana na nafasi ya kilele cha amide I na kinaweza kuwa na ukubwa sawa kwa sampuli zilizo na kiasi kikubwa cha maji, kama vile gel ya maji iliyosomwa hapa.Kwa hivyo, hatukujaribu kuoza kabisa kilele cha amide I, na uchunguzi wetu unapaswa kuzingatiwa tu ili kusaidia mbinu zingine kama vile uchunguzi wa NMR.
Suluhisho za 50 mg/ml NT na His-NT2RepCT ziliwekwa jeli usiku mmoja kwa 37°C.Kisha hidrojeni ilipunguzwa na 20 mm Tris-HCl (pH 8) hadi mkusanyiko wa 12.5 mg/ml, ikitikiswa vizuri na kupigwa bomba ili kuvunja gel.Kisha, hidrojeni ilipunguzwa mara 10 na 20 mm Tris-HCl (pH 8), 5 μl ya sampuli iliwekwa kwenye gridi ya shaba iliyopakwa fomu, na sampuli ya ziada iliondolewa kwa karatasi ya kufuta.Sampuli zilioshwa mara mbili kwa 5 µl za maji ya MilliQ na kuchafuliwa na 1% uranyl formate kwa dakika 5.Ondoa doa la ziada kwa karatasi ya kunyonya, kisha kavu mesh hewa.Upigaji picha ulifanywa kwenye gridi hizi kwa kutumia FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN inayofanya kazi kwa 100 kV.Picha hizo zilirekodiwa kwa ukubwa wa x 26,500 na x 43,000 kwa kutumia kamera ya CCD ya Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Ujerumani).Kwa kila sampuli (n = 1), picha 10-15 zilirekodiwa.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ilitumika kwa uchanganuzi wa picha na kipimo cha kipenyo cha nyuzi (n = 100, nyuzi tofauti).Prism 9 ilitumika kufanya vipimo vya t ambavyo havijaoanishwa (vilivyo na mikia miwili).Wastani wa nyuzi za His-NT2RepCT na NT zilikuwa 11.43 (SD 2.035) na 7.67 (SD 1.389) nm, mtawalia.Muda wa kujiamini (95%) ni -4.246 hadi -3.275.digrii za uhuru = 198, p <0.0001.
80 µl za sampuli za kioevu zilizo na 10 µM thioflavin T (ThT) zilipimwa katika nakala tatu (n = 3) chini ya hali tuli kwa kutumia mabamba ya chini ya chini yaliyo wazi ya Corning 96-vizuri nyeusi (Corning Glass 3881, Marekani).Tofauti za fluorescence zilirekodiwa kwa kutumia kichujio cha msisimko cha nm 440 na kichujio cha 480 nm (FLUOStar Galaxy kutoka BMG Labtech, Offenburg, Ujerumani).Ishara ya ThT haikujaa wala kuzimwa, kwani majaribio ya viwango tofauti vya ThT yalifanywa bila kubadilisha ukubwa wa mawimbi.Rekodi ya kunyonya kwa 360 nm kwa kipimo cha ukungu.Kwa majaribio ya upandaji mbegu, jeli 100 mg/mL ziliundwa kwa nyuzijoto 37° C., zikasimamishwa tena, na kutumika kwa ajili ya mbegu kwa uwiano wa molar wa 5%, 10% na 20%.Data ilichanganuliwa kwa kutumia Prism 9.
Thibitisha akiba za His-NT2RepCT na NT >100 mg/mL kwenye barafu na uchuje kupitia kichungi cha 0.22 µm.Viwango vilihesabiwa kwa kupima ufyonzaji kwa nm 280 kwa kutumia Nanodrop.Katika visima vya sahani nyeusi isiyofunga (Corning) yenye visima 96 na chini wazi, sampuli zilipunguzwa hadi 20 mg/ml katika 20 mm Tris-HCl pH 8 na kuchanganywa na 5 μM ThT (mkusanyiko wa mwisho), jumla ya mkusanyiko wa sampuli. Kiasi cha 50 μl.Sampuli zilipigwa picha kila baada ya dakika 10 kwa 37 °C kwenye darubini ya CellObserver (Zeiss) yenye chaneli ya mwanga inayopitishwa na seti za msisimko wa FITC na vichujio vya utoaji wa picha za ThT.Lenzi ya 20x/0.4 hutumiwa kupiga picha.Zen Blue (Zeiss) na ImageJ (https://imagej.nih.gov/) zilitumika kwa uchanganuzi wa picha.Geli pia zilitayarishwa kutoka kwa miyeyusho ya NT na His-NT2RepCT katika mkusanyiko wa 50 mg/mL iliyo na 20 mm Tris pH 8 na 5 µM ThT na kuangaziwa kwa 37°C kwa dakika 90.Vipande vya jeli vilihamishiwa kwenye kisima kipya kilicho na 20 mM Tris, pH 8, na 5 μM ThT katika sahani nyeusi isiyo na 96 iliyo wazi ya chini.Pata umeme wa kijani kibichi na picha za uga angavu kwa ukuzaji wa 20x/0.4.ImageJ ilitumika kwa uchanganuzi wa picha.
Mwonekano wa NMR wa Suluhisho ulipatikana kwa 310 K kwenye spectrometa ya 600 MHz Bruker Avance Neo iliyo na QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Sampuli za NMR zilizo na 10 mg/mL protini homogeneous yenye lebo ya 13C, 15N, iliyoyeyushwa katika 20 mm Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Mabadiliko ya kemikali ya NT2RepCT katika pH 6.7 yalitumiwa kuweka kilele 23 katika wigo wa 2D wa 15N-HSQC.
Mwonekano dhabiti wa NMR (MAS) unaozunguka wa 13C, hidrojeni zenye lebo 15N zilinakiliwa kwenye spectrometa ya Bruker Avance III HD katika 800 MHz iliyo na kifaa cha uchunguzi kisicho na kielektroniki cha 3.2 mm 13C/15N{1H}.Sampuli ya halijoto ilidhibitiwa kwa kutumia mkondo wa gesi wa halijoto ya 277 K. Mwongozo wa mzunguko wa dipole wa pande mbili (DARR)76 na uunganisho wa masafa ya redio (RFDR)77 spectra zilipatikana kwa masafa ya MAS ya 12.5 kHz na 20 kHz, mtawalia.Ugawanyaji tofauti (CP) kutoka 1H hadi 13C ulifanywa kwa kutumia njia unganishi ya mstari kutoka 60.0 hadi 48.0 kHz kwa 1H, 61.3/71.6 kHz kwa 13C (saa 12.5/20 kHz MAS) na muda wa mawasiliano 0.5–1 ms.Utenganishaji wa Spinal6478 kwa 73.5 kHz ulitumika wakati wa kukusanya data.Muda wa usakinishaji wa bidhaa ulikuwa milisekunde 10 na kuchelewa kwa mzunguko kulikuwa sekunde 2.5.Viunganishi vilivyounganishwa vya Cα/Cβ vilivyozingatiwa katika mwonekano wa RFDR viliwekwa kulingana na mabadiliko ya kemikali ya aina ya mabaki na miunganisho ya kuzidisha-zilizounganishwa katika spectra ya DARR.
Hifadhidata ya Zipper79 ( https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/ ) ilitumika kutathmini mielekeo ya flutter na nishati ya Rosetta kwa NT, NTFlSp, na NTMiSp.Hifadhidata ya Zipper inajumuisha Rosetta Energy80, ambayo inachanganya kazi kadhaa za bure za nishati ili kuiga na kuchanganua muundo wa protini.Kiwango cha nishati cha -23 kcal / mol au chini kinaonyesha tabia ya juu ya fibrillate.Nishati ya chini inamaanisha uthabiti zaidi wa nyuzi mbili za beta kwenye upatanishi wa zipu.Kwa kuongeza, algoriti ya Waltz ilitumiwa kutabiri maeneo ya amyloidogenic katika NT, NTFlSp na NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Myeyusho wa protini ya NT ulichanganywa na bafa ya 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) katika pH 5.5 na 6.0 ili kupunguza pH hadi pH 6 na 7, mtawalia.Mkusanyiko wa mwisho wa protini ulikuwa 100 mg / ml.
Vipimo vilifanywa kwenye spectrometer ya CD ya J-1500 (JASCO, USA) kwa kutumia cuvette ya 300 μL yenye njia ya macho ya 0.1 cm.Protini zilipunguzwa hadi 10 μM (n = 1) katika bafa ya phosphate ya mM 20 (pH 8).Ili kuchambua uthabiti wa protini mbele ya chumvi, protini zilichambuliwa kwa mkusanyiko sawa (n = 1) katika buffer ya phosphate ya 20 mm (pH 8) iliyo na 154 mM NaF au NaCl, kwa mtiririko huo.Vipimo vya halijoto vilirekodiwa kwa nm 222 kutoka 25°C hadi 95°C na kiwango cha joto cha 1°C/min.Uwiano wa protini zilizokunjwa asili ulikokotolewa kwa kutumia fomula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Zaidi ya hayo, spectra tano zilirekodiwa kwa kila sampuli kutoka nm 260 hadi 190 nm kwa 25°C na baada ya kupasha joto hadi 95°C.Maonyesho matano yalifanywa kwa wastani, yamelainishwa na kugeuzwa kuwa duaradufu ya molar.Data ilichanganuliwa kwa kutumia Prism 9.
Uzito wa fluorescence wa His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ulipimwa kwa pembe tatu (n = 3) katika bati za Corning zenye visima 96 na chini inayoangazia nyeusi (Corning Glass 3881, Marekani) chini ya hali tuli.Pima sampuli kwa kutumia kisoma sahani chenye msingi wa fluorescence chenye urefu wa msisimko wa nm 395 na urekodi utoaji huo kwa nm 509 kabla ya kuyeyuka na saa 2 baadaye saa 37°C.Data ilichanganuliwa na Prism 9.
Seti ya majaribio ya shughuli ya nucleoside phosphorylase ya Purine (njia ya fluorometric, Sigma Aldrich) ilitumiwa kulingana na maagizo ya mtengenezaji.Ili kupima shughuli katika jeli na miyeyusho iliyo na His-NT-PNP, changanya 10 ng ya His-NT-PNP na 100 mg/mL NT hadi jumla ya ujazo wa 2 µL kwa sababu jeli ilitoa ishara juu ya muda wa utambuzi wa seti.Vidhibiti vya jeli na miyeyusho bila His-NT-PNP vilijumuishwa.Vipimo vilifanyika mara mbili (n = 2).Baada ya shughuli kupimwa, mchanganyiko wa majibu uliondolewa na jeli ikapigwa picha ili kuhakikisha kuwa jeli inabakia sawa wakati wa kipimo.Data ilichanganuliwa kwa kutumia Prism 9.
Kwa habari zaidi juu ya muundo wa masomo, angalia mukhtasari wa utafiti wa Mazingira uliounganishwa na nakala hii.
Kielelezo 1 na 2 zinawasilisha data ya awali.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, na 6, Tini za Nyongeza.3, ziada tini.5a, d, mtini wa ziada.6 na tini ya ziada.8. Data Data kutoka kwa utafiti huu imepangishwa katika hifadhidata ya Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Data ya NMR iliyopatikana katika utafiti huu iliwekwa kwenye hazina ya BMRBig chini ya kitambulisho bmrbig36.Miundo ya GFP na PNP ilichukuliwa kutoka PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. na Johansson, J. Anazunguka hariri ya buibui bandia.Kemikali ya Taifa.biolojia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL na wengine.Jenomu ya Nephila clavipes huangazia utofauti wa jeni za hariri ya buibui na mwonekano wao changamano.Genette ya Taifa.49, 895–903 (2017).