304 Chuma cha pua kilichosogezwa mrija/tubing zhemical zomponent ,Uwezo wa Kibiolojia wa Microbiome ya Baharini Ulimwenguni

Asante kwa kutembelea Nature.com.Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer).Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Vitelezi vinavyoonyesha makala tatu kwa kila slaidi.Tumia vitufe vya nyuma na vinavyofuata ili kusogeza kwenye slaidi, au vitufe vya kidhibiti cha slaidi mwishoni ili kusogea kwenye kila slaidi.

Maelezo ya kina ya bidhaa

304 Chuma cha pua chenye mirija iliyosongeshwa
1. Uainishaji: Chuma cha pua coil tube / neli
2. Aina: svetsade au imefumwa
3. Kawaida: ASTM A269, ASTM A249
4. Coil tube ya chuma cha pua OD: 6mm hadi 25.4MM
5. Urefu: 600-3500MM au kulingana na mahitaji ya mteja.
6. Unene wa ukuta: 0.2mm hadi 2.0mm.

7. Uvumilivu: OD: +/-0.01mm;Unene: +/-0.01%.

8. Saizi ya shimo la ndani la coil: 500MM-1500MM (inaweza kubadilishwa kulingana na mahitaji ya mteja)

9. Urefu wa coil: 200MM-400MM (inaweza kubadilishwa kulingana na mahitaji ya mteja)

10. Uso: Kung'aa au kuchujwa
11. Nyenzo: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, aloi 625, 825, 2205, 2507, nk.
12. Ufungashaji: mifuko iliyosokotwa katika sanduku la mbao, godoro la mbao, shimoni la mbao, au kulingana na mahitaji ya mteja.
13. Mtihani : sehemu ya kemikali, nguvu ya mavuno, nguvu ya mvutano, kipimo cha ugumu
14. Dhamana: Ukaguzi wa wahusika wengine (kwa mfano :SGS TV ), n.k.
15. Maombi: Mapambo, samani, usafiri wa mafuta, mchanganyiko wa joto, kutengeneza matusi, kutengeneza karatasi, gari, usindikaji wa chakula, matibabu, nk.

Jumuiya za vijiumbe asilia zinatofautiana kifilojenetiki na kimetaboliki.Kando na vikundi vya viumbe ambavyo havijajifunza1, uanuwai huu pia una uwezo mkubwa wa ugunduzi wa vimeng'enya muhimu vya kiikolojia na kibayoteknolojia na misombo ya biokemikali2,3.Hata hivyo, kusoma uanuwai huu ili kubaini njia za jeni zinazounganisha misombo kama hii na kuzifunga kwa wapangishaji husika bado ni changamoto.Uwezo wa kibiosynthetic wa vijiumbe katika bahari ya wazi bado haujulikani kwa kiasi kikubwa kutokana na mapungufu katika uchanganuzi wa data nzima ya azimio la jenomu katika kiwango cha kimataifa.Hapa, tunachunguza utofauti na utofauti wa makundi ya jeni ya kibayolojia katika bahari kwa kuunganisha jenasi ndogo ndogo 10,000 kutoka seli zilizokuzwa na seli moja zenye zaidi ya 25,000 za rasimu mpya zilizoundwa upya kutoka kwa zaidi ya sampuli 1,000 za maji ya bahari.Juhudi hizi zimebainisha takriban makundi 40,000 ya jeni hasa mapya ya kibayolojia, ambayo baadhi yake yamepatikana katika vikundi vya filojenetiki ambavyo havikutarajiwa hapo awali.Katika makundi haya, tulitambua ukoo ulioboreshwa katika makundi ya jeni ya kibiosynthetic (“Candidatus Eudormicrobiaceae”) ambayo yalikuwa ya phylum ya bakteria ambayo hayajakuzwa na kujumuisha baadhi ya vijiumbe vya aina mbalimbali vya kibiolojia katika mazingira haya.Kati ya hizi, tumebainisha njia za phosphatase-peptidi na pytonamide, kutambua matukio ya muundo usio wa kawaida wa kiwanja cha bioactive na enzymology, kwa mtiririko huo.Kwa kumalizia, utafiti huu unaonyesha jinsi mikakati ya msingi wa microbiome inaweza kuwezesha uchunguzi wa vimeng'enya visivyoelezewa hapo awali na vyakula asilia katika mikrobiota na mazingira ambayo hayaeleweki vizuri.
Vijiumbe huendesha mizunguko ya kibayolojia ya kimataifa, kudumisha utando wa chakula, na kuweka mimea na wanyama wakiwa na afya5.Utofauti wao mkubwa wa filojenetiki, kimetaboliki na utendaji kazi unawakilisha uwezekano mkubwa wa ugunduzi wa taxa1 mpya, vimeng'enya na misombo ya kemikali ya kibayolojia, ikijumuisha bidhaa asilia6.Katika jumuiya za kiikolojia, molekuli hizi hutoa microorganisms na aina mbalimbali za kazi za kisaikolojia na kiikolojia, kutoka kwa mawasiliano hadi mashindano 2, 7 .Kando na utendakazi wao asilia, bidhaa hizi asilia na njia zao za uzalishaji zenye kanuni za kijeni hutoa mifano kwa matumizi ya kibayoteknolojia na matibabu2,3.Utambulisho wa njia na viunganisho kama hivyo umewezeshwa sana na utafiti wa vijidudu vilivyokuzwa.Hata hivyo, tafiti za taxonomic za mazingira asilia zimeonyesha kuwa idadi kubwa ya vijiumbe haijakuzwa8.Upendeleo huu wa kitamaduni unapunguza uwezo wetu wa kutumia utofauti wa utendaji uliosimbwa na vijiumbe vidogo vingi4,9.
Ili kuondokana na mapungufu haya, maendeleo ya kiteknolojia katika muongo mmoja uliopita yameruhusu watafiti moja kwa moja (yaani, bila utamaduni wa awali) kupanga vipande vya DNA vidogo kutoka kwa jumuiya nzima (metagenomics) au seli moja.Uwezo wa kuunganisha vipande hivi katika vipande vikubwa vya jenomu na kuunda upya jenomu nyingi zilizounganishwa kimaumbile (MAGs) au jenomu moja iliyokuzwa (SAGs), mtawalia, hufungua fursa muhimu kwa ajili ya tafiti zinazozingatia kodi za mikrobiomu (yaani, jumuiya za viumbe vidogo na mikrobiomu).tengeneza njia mpya.nyenzo za kijeni katika mazingira fulani) 10,11,12.Hakika, tafiti za hivi majuzi zimepanua pakubwa uwakilishi wa kifilojenetiki wa aina mbalimbali za viumbe hai kwenye Dunia1, 13 na zimefichua wingi wa uanuwai wa utendaji katika jumuiya za viumbe hai ambazo hazikushughulikiwa hapo awali na mfuatano wa marejeleo ya viumbe vidogo vilivyokuzwa (REFs)14.Uwezo wa kuweka uanuwai wa utendaji ambao haujagunduliwa katika muktadha wa jenomu mwenyeji (yaani, azimio la jenomu) ni muhimu kwa ajili ya kutabiri njia za vijiumbe ambazo bado hazijabainishwa ambazo huenda zimesimba bidhaa mpya za asili15,16 au kwa kufuatilia misombo kama hiyo hadi kwa mtengenezaji wao asili17.Kwa mfano, mkabala wa uchanganuzi wa kimetagenomiki na chembe moja ya jeni umesababisha kutambuliwa kwa Candidatus Entotheonella, kundi la bakteria yenye kimetaboliki inayohusishwa na sifongo, kama wazalishaji wa aina mbalimbali za uwezekano wa madawa18.Hata hivyo, licha ya majaribio ya hivi majuzi ya uchunguzi wa jeni wa jumuiya mbalimbali za viumbe hai,16,19 zaidi ya theluthi mbili ya data ya kimataifa ya metagenomic kwa bahari kubwa zaidi ya mifumo ikolojia16,20 bado haipo.Kwa hivyo, kwa ujumla, uwezo wa kibayolojia wa microbiome ya baharini na uwezo wake kama hifadhi ya riwaya ya enzymatic na bidhaa za asili bado haujasomewa kwa kiasi kikubwa.
Ili kuchunguza uwezo wa kibiosanisi wa viumbe hai vya baharini kwa kiwango cha kimataifa, kwanza tulikusanya jenomu ndogondogo za baharini zilizopatikana kwa kutumia mbinu zinazotegemea utamaduni na zisizo za kitamaduni ili kuunda hifadhidata pana ya filojenetiki na utendaji kazi wa jeni.Uchunguzi wa hifadhidata hii ulibaini aina mbalimbali za makundi ya jeni ya kibayolojia (BGC), ambayo mengi ni ya familia ambazo bado hazijajulikana (GCF).Zaidi ya hayo, tulitambua familia ya bakteria isiyojulikana ambayo inaonyesha aina nyingi zaidi zinazojulikana za BGC katika bahari ya wazi hadi sasa.Tulichagua njia mbili za awali za ribosomal na peptidi iliyorekebishwa baada ya kutafsiri (RiPP) kwa uthibitishaji wa majaribio kulingana na tofauti zao za kijeni kutoka kwa njia zinazojulikana kwa sasa.Tabia ya utendaji ya njia hizi imefunua mifano isiyotarajiwa ya enzymology pamoja na misombo isiyo ya kawaida ya kimuundo na shughuli ya kuzuia protease.
Mwanzoni, tulilenga kuunda rasilimali ya data ya kimataifa kwa uchanganuzi wa jenomu, tukizingatia vipengele vyake vya bakteria na archaeal.Ili kufikia lengo hili, tulikusanya data ya metagenomic na sampuli 1038 za maji ya bahari kutoka tovuti 215 za sampuli zilizosambazwa kimataifa (latitudo = 141.6°) na tabaka kadhaa za kina (kutoka 1 hadi 5600 m kwa kina, zinazofunika ukanda wa pelagic, mesopelagic na abyssal).Background21,22,23 (Mchoro 1a, data iliyopanuliwa, Mchoro 1a na Jedwali la Nyongeza 1).Mbali na kutoa habari nyingi za kijiografia, sampuli hizi zilizochujwa kwa kuchagua zilituruhusu kulinganisha vipengee mbalimbali vya viumbe hai vya baharini, ikiwa ni pamoja na tajiriba ya virusi (<0.2 µm), prokaryotic-tajiri (0.2–3 µm), chembe chembe (0.8 µm). )-20 µm) na makoloni yaliyo na virusi (>0.2 µm).
a, Jumla ya jenomu 1038 zinazopatikana kwa umma (metagenomics) za jumuiya za viumbe vidogo vya baharini zilizokusanywa kutoka maeneo 215 yaliyosambazwa kimataifa (62°S hadi 79°N na 179°W hadi 179°E.).Vigae vya ramani © Esri.Vyanzo: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ, na Esri.b, metagenome hizi zilitumiwa kuunda upya MAG (mbinu na maelezo ya ziada), ambayo hutofautiana kwa wingi na ubora (mbinu) katika hifadhidata (iliyowekwa alama ya rangi).MAG zilizoundwa upya ziliongezewa na jenomu zinazopatikana hadharani (za nje), ikijumuisha MAG26, SAG27 na REF iliyotengenezwa kwa mikono.27 Kukusanya OMD.c, ikilinganishwa na ripoti za awali kulingana na SAG (GORG)20 au MAG (GEM)16 pekee, OMD inaboresha sifa za jeni za jumuiya za viumbe vidogo vya baharini (kiwango cha ramani ya usomaji wa metagenomic; mbinu) mara mbili hadi tatu kwa uwakilishi thabiti zaidi na wa kina. latitudo..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° . takriban spishi 8300, zaidi ya nusu ambazo hazijaainishwa hapo awali kwa mujibu wa maelezo ya taksinomia kwa kutumia GTDB (toleo la 89) e, uainishaji wa spishi kwa aina ya jenomu ulionyesha kuwa MAG, SAG na REF zinakamilishana vyema katika kuakisi utofauti wa filojenetiki ya microbiome ya baharini.Hasa, 55%, 26% na 11% ya aina walikuwa maalum kwa MAG, SAG na REF, kwa mtiririko huo.BATS, Bermuda Atlantic Time Series;GEM, jenomu za microbiome ya Dunia;GORG, jenomu ya kumbukumbu ya bahari ya kimataifa;HOT, mfululizo wa saa wa Bahari ya Hawaii.
Kwa kutumia mkusanyiko huu wa data, tuliunda upya jumla ya MAG 26,293, nyingi zikiwa za bakteria na za kiakiolojia (Mchoro 1b na data iliyopanuliwa, Mtini. 1b).Tumeunda MAGS hizi kutoka kwa mikusanyiko kutoka kwa sampuli tofauti badala ya kuunganishwa kwa metagenomic ili kuzuia kuporomoka kwa tofauti za mlolongo wa asili kati ya sampuli kutoka maeneo tofauti au pointi za saa (mbinu).Zaidi ya hayo, tulipanga vipande vya jeni kulingana na uwiano wao wa kuenea katika idadi kubwa ya sampuli (kutoka sampuli 58 hadi 610, kulingana na uchunguzi; mbinu).Tuligundua kuwa hii ni hatua inayotumia wakati lakini muhimu24 ambayo ilirukwa katika kazi kadhaa kubwa za ujenzi wa MAG16, 19, 25 na kuboresha kwa kiasi kikubwa idadi (mara 2.7 kwa wastani) na ubora (+20% kwa wastani) ya jenomu.upya kutoka kwa metagenome ya baharini iliyojifunza hapa (data iliyopanuliwa, Mchoro 2a na maelezo ya ziada).Kwa ujumla, jitihada hizi zilisababisha ongezeko la mara 4.5 la MAGS ya microbial ya baharini (mara 6 ikiwa ni MAGS ya ubora tu yanazingatiwa) ikilinganishwa na rasilimali ya kina zaidi ya MAG inapatikana leo16 (Mbinu).Seti hii mpya ya MAG iliunganishwa na MAG26s 830, 5969 SAG27s na 1707 REFs.Aina ishirini na saba za bakteria za baharini na archaea ziliunda mkusanyiko wa mchanganyiko wa jenomu 34,799 (Mchoro 1b).
Kisha tukatathmini rasilimali mpya iliyoundwa ili kuboresha uwezo wake wa kuwakilisha jumuiya za viumbe vidogo vya baharini na kutathmini athari ya kuunganisha aina tofauti za jenomu.Kwa wastani, tuligundua kuwa inashughulikia takriban 40-60% ya data ya metagenomic ya baharini (Mchoro 1c), mara mbili hadi tatu ya chanjo ya ripoti za awali za MAG pekee katika kina na latitudo More serial 16 au SAG20.Zaidi ya hayo, ili kupima kwa utaratibu uanuwai wa taksonomia katika makusanyo yaliyoanzishwa, tulibainisha jenomu zote kwa kutumia zana (mbinu) za Genome Taxonomy Database (GTDB) na tukatumia wastani wa utambulisho wa nyukleotidi ya upana wa 95%.28 ili kutambua makundi ya spishi 8,304 (aina).Theluthi mbili ya spishi hizi (pamoja na safu mpya) hazijaonekana hapo awali kwenye GTDB, ambapo 2790 ziligunduliwa kwa kutumia MAG iliyojengwa upya katika utafiti huu (Mchoro 1d).Kwa kuongezea, tuligundua kuwa aina tofauti za jenomu zinakamilishana sana: 55%, 26%, na 11% ya spishi zinajumuishwa kabisa na MAG, SAG, na REF, mtawaliwa (Mchoro 1e).Kwa kuongezea, MAG ilishughulikia aina zote 49 zilizopatikana kwenye safu ya maji, wakati SAG na REF ziliwakilisha 18 na 11 tu kati yao, mtawaliwa.Hata hivyo, SAG inawakilisha vyema zaidi utofauti wa makundi ya kawaida (data iliyopanuliwa, Kielelezo 3a), kama vile Bakteria za Pelagic (SAR11), huku SAG ikijumuisha takriban spishi 1300 na MAG spishi 390 pekee.Hasa, REFs hazikuingiliana na MAG au SAGs katika kiwango cha spishi na iliwakilisha >95% ya takriban jenomu 1000 ambazo hazikupatikana katika seti za metagenomic za bahari wazi zilizosomwa hapa, haswa kwa sababu ya mwingiliano na aina zingine za vielelezo wakilishi vya baharini (km mashapo) .au mwenyeji-mshirika).Ili kuifanya ipatikane kwa wingi kwa jumuiya ya wanasayansi, rasilimali hii ya jenomu ya baharini, ambayo pia inajumuisha vipande ambavyo havijaainishwa (kwa mfano, kutoka kwa fagio zilizotabiriwa, visiwa vya genomic, na vipande vya jenomu ambavyo hakuna data ya kutosha kwa ujenzi wa MAG), inaweza kulinganishwa na data ya ushuru. .Fikia vidokezo pamoja na utendaji wa jeni na vigezo vya muktadha katika Hifadhidata ya Biolojia ya Bahari (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Kisha tuliazimia kuchunguza utajiri na uvumbuzi wa uwezo wa kibayolojia katika viumbe hai vya baharini wazi.Kufikia hili, kwanza tulitumia antiSMASH kwa MAGS, SAG na REF zote zinazopatikana katika metagenomes (mbinu) 1038 za baharini kutabiri jumla ya BGC 39,055.Kisha tuliziweka katika vikundi 6907 vya GCF zisizohitajika na vikundi 151 vya makundi ya jeni (GCCs; Jedwali la Ziada 2 na mbinu) ili kuhesabu upungufu wa asili (yaani, BGC sawa inaweza kusimba katika jenomu nyingi) na data ya metagenomic Kugawanyika kwa BGC zilizokolezwa .BGC ambazo hazijakamilika hazikuongeza sana, kama zipo (Maelezo ya Ziada), idadi ya GCFs na GCCs, mtawalia, zilizo na angalau mwanachama mmoja wa BGC katika 44% na 86% ya kesi.
Katika kiwango cha GCC, tulipata aina mbalimbali za RiPP zilizotabiriwa na bidhaa nyingine asilia (Mchoro 2a).Miongoni mwao, kwa mfano, arylpolyenes, carotenoids, ectoines, na siderophores ni mali ya GCCs yenye usambazaji mkubwa wa phylogenetic na wingi wa juu wa metagenomes ya bahari, ambayo inaweza kuonyesha urekebishaji mpana wa vijidudu kwa mazingira ya baharini, pamoja na upinzani wa spishi tendaji za oksijeni. mkazo wa oksidi na osmotic..au kunyonya chuma (maelezo zaidi).Uanuwai huu wa kiutendaji unatofautiana na uchanganuzi wa hivi majuzi wa takriban BGC milioni 1.2 kati ya takriban jenomu 190,000 zilizohifadhiwa katika hifadhidata ya NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, ambayo baadaye inajulikana kama RefSeq)29, ambayo ilionyesha kuwa peptidi zisizo za ribosomal Synthetase (NRPS) na polyketide synthethase. (PKS) BGCs (Maelezo ya Ziada).Pia tulipata GCC 44 (29%) zinazohusiana kwa mbali pekee na RefSeq BGC yoyote (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; Mchoro 2a na mbinu) na GCC 53 (35%) pekee kwenye MAG , ikiangazia uwezo kugundua kemikali ambazo hazijaelezewa hapo awali katika OMD.Kwa kuzingatia kwamba kila moja ya GCC hizi ina uwezekano wa kuwakilisha utendakazi tofauti-tofauti wa kibayolojia, tulichanganua zaidi data katika kiwango cha GCF katika jitihada za kutoa kambi ya kina zaidi ya BGC zilizotabiriwa kuweka msimbo wa bidhaa asilia zinazofanana29.Jumla ya 3861 (56%) zilizotambuliwa hazikuingiliana na RefSeq, na >97% ya GCFs hazikuwepo katika MIBiG, mojawapo ya hifadhidata kubwa zaidi za BGC zilizothibitishwa kwa majaribio (Mchoro 2b).Ingawa haishangazi kugundua njia nyingi za riwaya zinazowezekana katika mipangilio ambayo haijawakilishwa vyema na jenomu ya marejeleo, mbinu yetu ya kutoa nakala za BGC katika GCFs kabla ya ulinganishaji inatofautiana na ripoti za awali 16 na huturuhusu kutoa tathmini isiyopendelea ya mambo mapya.Anuwai nyingi mpya (3012 GCF au 78%) zinalingana na terpenes zilizotabiriwa, RiPP au bidhaa zingine asilia, na nyingi (1815 GCF au 47%) zimesimbwa kwa aina zisizojulikana kwa sababu ya uwezo wao wa kibiolojia.Tofauti na makundi ya PKS na NRPS, BGC hizi zilizoshikana zina uwezekano mdogo wa kugawanywa wakati wa mkusanyiko wa metagenomic 31 na kuruhusu utendakazi zaidi wa muda na rasilimali wa bidhaa zao.
Jumla ya BGCs 39,055 ziliwekwa katika GCFs 6,907 na GCCs 151.a, uwakilishi wa data (ndani ya nje).Muunganisho wa daraja la umbali wa BGC kulingana na GCC, 53 kati yake umewekwa na MAG pekee.GCC ina BGC kutoka taxa tofauti (frequency ya lango iliyobadilishwa) na aina tofauti za BGC (ukubwa wa mduara unalingana na marudio yake).Kwa kila GCC, safu ya nje inawakilisha idadi ya BGC, kuenea (asilimia ya sampuli), na umbali (kiwango cha chini kabisa cha umbali wa BGC cosine (min(dMIBiG))) kutoka BiG-FAM hadi BGC.GCC zilizo na BGC zinazohusiana kwa karibu na BGC zilizoidhinishwa kwa majaribio (MIBiG) zimeangaziwa kwa mishale.b Kulinganisha GCF na BGC zilizotabiriwa (BiG-FAM) na zilizothibitishwa kwa majaribio (MIBiG), GCF mpya 3861 (d–>0.2) zilipatikana.Nyingi (78%) ya misimbo hii ya RiPP, terpenes, na bidhaa nyinginezo za asili.c, jenomu zote katika OMD zilizopatikana katika metagenomes za baharini 1038 ziliwekwa kwenye mti wa msingi wa GTDB ili kuonyesha ufunikaji wa filojenetiki ya OMD.Daraja zisizo na jenomu zozote katika OMD zinaonyeshwa kwa rangi ya kijivu.Idadi ya BGC inalingana na idadi kubwa zaidi ya BGC zilizotabiriwa kwa kila jenomu katika safu fulani.Kwa uwazi, 15% ya mwisho ya nodes zimeanguka.Mishale huonyesha makundi yenye BGC (>15 BGC), isipokuwa Mycobacterium, Gordonia (ya pili baada ya Rhodococcus), na Crocosphaera (ya pili baada ya Synechococcus).d, Haijulikani c.Eremiobacterota ilionyesha anuwai ya juu zaidi ya kibayolojia (kiashiria cha Shannon kulingana na aina ya bidhaa asilia).Kila bendi inawakilisha jenomu iliyo na BGC nyingi zaidi katika spishi.T1PKS, PKS aina ya I, T2/3PKS, PKS aina ya II na aina III.
Mbali na utajiri na mambo mapya, tunachunguza muundo wa kijiografia wa uwezo wa kibiolojia wa viumbe hai vya baharini.Upangaji wa sampuli kwa wastani wa usambazaji wa nambari za nakala za GCF (Mbinu) ulionyesha kuwa jamii zenye latitudo ya chini, uso, tajiriba ya prokaryotic na maskini wa virusi, hasa kutoka kwenye maji ya juu au ya kina zaidi ya jua, zilikuwa na tajiri katika RiPP na BGC terpenes.Kinyume chake, jumuiya za polar, deep-sea, virusi- na chembe-chembe zilihusishwa na wingi wa juu wa NRPS na PKS BGC (data iliyopanuliwa, Mtini. 4 na maelezo ya ziada).Hatimaye, tuligundua kuwa jumuiya za tropiki na pelagis zilizosomwa vyema ndizo vyanzo vya matumaini vya terpenes mpya (Kielelezo cha Data Iliyoongezwa).Uwezo mkubwa wa PKS, RiPP na bidhaa zingine asilia (Mchoro 5a na data iliyopanuliwa).
Ili kukamilisha utafiti wetu wa uwezo wa kibiosanisi wa viumbe hai vya baharini, tulilenga kuweka ramani ya usambazaji wao wa kifilojenetiki na kutambua aina mpya za BGC zilizoboreshwa.Ili kufikia mwisho huu, tuliweka jenomu za vijiumbe vya baharini kwenye mti wa kawaida wa GTDB13 wa bakteria na archaeal phylogenetic na kufunika njia za kuweka kibayolojia wanazosimba (Mchoro 2c).Tumegundua kwa urahisi aina kadhaa za BGC (zinazowakilishwa na zaidi ya BGC 15) katika sampuli za maji ya bahari (mbinu) zinazojulikana kwa uwezo wao wa kibiolojia, kama vile cyanobacteria (Synechococcus) na bakteria ya Proteus, kama vile Tistrella32,33, au zilizovutia umakini wao hivi majuzi. bidhaa za asili.kama vile Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus na Planctomycetota34,35,36.Cha kufurahisha, tulipata nasaba kadhaa ambazo hazijagunduliwa hapo awali katika safu hizi.Kwa mfano, spishi hizo zilizo na uwezo mkubwa zaidi wa kibayolojia katika phyla Planctomycetota na Myxococota zilitokana na maagizo na genera za wagombeaji zisizo na sifa, mtawalia (Jedwali la Ziada 3).Ikichukuliwa pamoja, hii inapendekeza kwamba OMD hutoa ufikiaji wa maelezo ya filojenetiki ambayo hayakujulikana hapo awali, ikiwa ni pamoja na viumbe vidogo, ambavyo vinaweza kuwakilisha shabaha mpya za ugunduzi wa kimeng'enya na bidhaa asilia.
Kisha, tuliangazia safu iliyoboreshwa ya BGC kwa sio tu kuhesabu idadi ya juu zaidi ya BGC zilizosimbwa na wanachama wake, lakini pia kwa kutathmini utofauti wa BGC hizi, ambayo inaelezea marudio ya aina tofauti za bidhaa za mgombea asili (Kielelezo 2c na mbinu ).Tuligundua kuwa spishi nyingi tofauti za kibiolojia ziliwakilishwa na MAGS za bakteria zilizoundwa mahususi katika utafiti huu.Bakteria hizi ni za phylum Candidatus Eremiobacterota ambayo haijapandwa, ambayo bado haijagunduliwa kwa kiasi kikubwa mbali na tafiti chache za genomic37,38.Ni vyema kutambua kwamba "ca.Jenasi ya Eremiobacterota imechanganuliwa tu katika mazingira ya nchi kavu39 na haijulikani kujumuisha wanachama wowote walioboreshwa katika BGC.Hapa tumejenga upya MAGS nane za aina moja (utambulisho wa nucleotidi> 99%) 23. Kwa hiyo tunapendekeza jina la aina "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii", lililopewa jina la nereid (nymph bahari), zawadi nzuri katika mythology ya Kigiriki na safari.'Kaa.Kulingana na kidokezo cha phylogenetic 13, E. malaspinii hana jamaa aliyejulikana hapo awali chini ya kiwango cha mfuatano na hivyo ni wa familia mpya ya bakteria ambayo tunapendekeza “Ca.E. malaspinii” kama aina ya spishi na “Ca.Eudormicrobiaceae” kama jina rasmi (Maelezo ya Ziada).Muhtasari wa ujenzi mpya wa 'Ca.Mradi wa E. malaspinii wa jenomu uliidhinishwa na ingizo la chini sana, mpangilio wa metagenomic uliosomwa kwa muda mrefu na mkusanyiko lengwa wa sampuli moja (Mbinu) kama kromosomu moja ya mstari wa 9.63 Mb yenye rudufu ya kb 75.kama utata uliobaki.
Ili kubaini muktadha wa filojenetiki ya spishi hii, tulitafuta spishi 40 zinazohusiana kwa karibu katika sampuli za ziada za metagenomic iliyoboreshwa ya yukariyoti kutoka msafara wa Bahari ya Tara kupitia uundaji upya wa jenomu unaolengwa.Kwa ufupi, tumeunganisha usomaji wa metagenomic na vipande vya jeni vinavyohusishwa na "Ca.E. malaspinii” na kukisiwa kuwa ongezeko la kiwango cha uajiri katika sampuli hii linaonyesha kuwepo kwa jamaa wengine (mbinu).Matokeo yake, tulipata MAGS 10, mchanganyiko wa MAGS 19 zinazowakilisha aina tano katika genera tatu ndani ya familia mpya iliyofafanuliwa (yaani "Ca. Eudormicrobiaceae").Baada ya ukaguzi wa mwongozo na udhibiti wa ubora (data iliyopanuliwa, Kielelezo 6 na maelezo ya ziada), tuligundua kuwa "Ca.Spishi za Eudormicrobiaceae zinawasilisha jenomu kubwa zaidi (8 Mb) na uwezo mkubwa wa kibiolojia (14 hadi 22 BGC kwa kila spishi) kuliko wanachama wengine wa "Ca".Clade Eremiobacterota (hadi 7 BGC) (Mchoro 3a-c).
a, Phylogenetic nafasi ya tano 'Ca.Aina za Eudormicrobiaceae zilionyesha utajiri wa BGC mahususi kwa njia za baharini zilizoainishwa katika utafiti huu.Mti wa phylogenetic ni pamoja na 'Ca.MAG Eremiobacterota na washiriki wa phyla nyingine (nambari za jenomu kwenye mabano) zinazotolewa katika GTDB (toleo la 89) zilitumika kwa usuli wa mageuzi (Mbinu).Tabaka za nje zinawakilisha uainishaji katika ngazi ya familia ("Ca. Eudormicrobiaceae" na "Ca. Xenobiaceae") na katika kiwango cha darasa ("Ca. Eremiobacteria").Aina tano zilizoelezewa katika utafiti huu zinawakilishwa na misimbo ya alphanumeric na majina ya binomial yaliyopendekezwa (Maelezo ya Ziada).b, sawa.Spishi za Eudormicrobiaceae hushiriki viini saba vya kawaida vya BGC.Kutokuwepo kwa BGC katika safu ya A2 kulitokana na kutokamilika kwa mwakilishi wa MAG (Jedwali la Nyongeza 3).BGCs ni maalum kwa "Ca.Amphithomicrobium" na "Ca.Amphithomicrobium” (clade A na B) hazijaonyeshwa.c, BGC zote zimesimbwa kama “Ca.Eudoremicrobium taraoceanii ilipatikana kuonyeshwa katika metaranscripttomes 623 zilizochukuliwa kutoka kwa bahari ya Tara.Miduara thabiti inaonyesha unukuzi unaotumika.Miduara ya chungwa inaashiria mabadiliko ya mkunjo yaliyogeuzwa logi2 chini na juu ya kiwango cha usemi wa jeni za utunzaji wa nyumba (mbinu).d, mikunjo ya wingi (mbinu) inayoonyesha 'Ca.Aina za Eudormicrobiaceae zimeenea katika mabonde mengi ya bahari na katika safu nzima ya maji (kutoka juu ya uso hadi kina cha angalau 4000 m).Kulingana na makadirio haya, tuligundua kuwa 'Ca.E. malaspinii' huchangia hadi 6% ya seli za prokaryotic katika jumuiya zinazohusishwa na nafaka za pelagis ya kina-bahari.Tulizingatia spishi kuwapo kwenye tovuti ikiwa ilipatikana katika sehemu yoyote ya saizi ya safu fulani ya kina.IO - Bahari ya Hindi, NAO - Atlantiki ya Kaskazini, NPO - Pasifiki ya Kaskazini, RS - Bahari ya Shamu, SAO - Atlantiki ya Kusini, SO - Bahari ya Kusini, SPO - Pasifiki ya Kusini.
Kusoma wingi na usambazaji wa Ca.Eudormicrobiaceae, ambayo, kama tulivyopata, inatawala katika mabonde mengi ya bahari, na pia katika safu nzima ya maji (Mchoro 3d).Ndani ya nchi, wanaunda 6% ya jumuiya ya viumbe vidogo vya baharini, na kuwafanya kuwa sehemu muhimu ya microbiome ya kimataifa ya baharini.Kwa kuongeza, tulipata maudhui ya jamaa ya Ca.Spishi za Eudormicrobiaceae na viwango vyao vya kujieleza vya BGC vilikuwa vya juu zaidi katika sehemu iliyoboreshwa ya yukariyoti (Mchoro 3c na data iliyopanuliwa, Mtini. 7), ikionyesha mwingiliano unaowezekana na chembechembe, pamoja na planktoni.Uchunguzi huu una mfanano fulani na 'Ca.Eudoremicrobium BGCs zinazozalisha bidhaa asilia za cytotoxic kupitia njia zinazojulikana zinaweza kuonyesha tabia ya uwindaji (Maelezo ya Ziada na Data Iliyopanuliwa, Kielelezo 8), sawa na wanyama wanaokula wanyama wengine ambao huzalisha hasa metabolites kama vile Myxococcus41.Ugunduzi wa Ca.Eudormicrobiaceae katika sehemu ndogo (bahari ya kina kirefu) au sampuli za yukariyoti badala ya prokaryotic zinaweza kueleza ni kwa nini bakteria hizi na tofauti zao zisizotarajiwa za BGC bado hazieleweki katika muktadha wa utafiti wa chakula asilia.
Hatimaye, tulitafuta kuthibitisha kwa majaribio ahadi ya kazi yetu inayotegemea mikrobiome katika kugundua njia mpya, vimeng'enya na bidhaa asilia.Miongoni mwa aina tofauti za BGCs, njia ya RiPP inajulikana kusimba kemikali nyingi na utendakazi tofauti kutokana na marekebisho mbalimbali ya baada ya tafsiri ya peptidi kuu na vimeng'enya vilivyokomaa42.Kwa hivyo tulichagua 'Ca mbili.Eudoremicrobium' RiPP BGCs (Takwimu 3b na 4a-e) zinategemea sawa na BGC yoyote inayojulikana (\(\bar{d}\)MIBiG na \(\bar{d}\)RefSeq juu ya 0.2) .
a–c, In vitro heterologous expression and in vitro enzymatic assays ya riwaya (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) nguzo ya RiPP biosynthesis mahususi kwa spishi za Ca bahari kuu.E. malaspinii' ilisababisha uzalishaji wa bidhaa za diphosphorylated.c, marekebisho yaliyotambuliwa kwa kutumia high-resolution (HR) MS/MS (mgawanyiko unaoonyeshwa na b na ioni y katika muundo wa kemikali) na NMR (data iliyopanuliwa, Mchoro 9).d, peptidi hii ya fosforasi huonyesha kizuizi cha chini cha micromolar ya elastase ya mamalia ya neutrophil, ambayo haipatikani katika peptidi ya udhibiti na peptidi ya dehydrating (kuondolewa kwa kemikali kunasababishwa na upungufu wa maji mwilini).Jaribio lilirudiwa mara tatu na matokeo sawa.Kwa mfano, usemi wa kutofautisha wa riwaya ya pili \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) nguzo ya usanisi wa protini hufafanua utendakazi wa vimeng'enya vinne vilivyokomaa ambavyo hurekebisha peptidi 46 ya msingi ya amino asidi.Mabaki yametiwa madoa kulingana na tovuti ya urekebishaji iliyotabiriwa na HR-MS/MS, uwekaji lebo za isotopu, na uchanganuzi wa NMR (Maelezo ya Ziada).Upakaji rangi uliosindikwa unaonyesha kuwa urekebishaji hutokea katika mojawapo ya mabaki hayo mawili.Kielelezo ni mkusanyiko wa miundo mingi tofauti kuonyesha shughuli ya vimeng'enya vyote vilivyokomaa kwenye kiini kimoja.h, Mchoro wa data ya NMR kwa uti wa mgongo amide N-methylation.Matokeo kamili yanaonyeshwa kwenye Mtini.10 na data iliyopanuliwa.i, Nafasi ya Phylogenetic ya kimeng'enya cha nguzo ya protini ya FkbM iliyokomaa kati ya vikoa vyote vya FkbM vinavyopatikana katika hifadhidata ya MIBiG 2.0 hufichua kimeng'enya cha familia hii chenye shughuli ya N-methyltransferase (Maelezo ya Ziada).Michoro ya kiratibu ya BGCs (a, e), miundo ya peptidi ya utangulizi (b, f), na miundo ya kemikali ya bidhaa asilia (c, g) inaonyeshwa.
Njia ya kwanza ya RiPP (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) ilipatikana tu katika spishi za bahari kuu "Ca.E. malaspinii” na misimbo ya mtangulizi wa Peptide (Mchoro 4a, b).Katika kimeng'enya hiki kilichokomaa, tumetambua kikoa kimoja cha utendaji kazi sawa na kikoa cha kutokomeza maji mwilini cha synthase ya lantipeptide ambayo kwa kawaida huchochea fosforasi na kuondolewa kwa 43 (Maelezo ya Ziada).Kwa hiyo, tunatabiri kwamba urekebishaji wa peptidi ya mtangulizi unahusisha upungufu huo wa hatua mbili.Hata hivyo, kwa kutumia tandem molekuli spectrometry (MS/MS) na nyuklia magnetic resonance spectroscopy (NMR), sisi kutambuliwa polyphosphorylated linear peptidi (Mtini. 4c).Ingawa haikutarajiwa, tulipata ushahidi kadhaa wa kuunga mkono kuwa bidhaa yake ya mwisho: wapangaji wawili tofauti tofauti na hakuna upungufu wa maji mwilini katika majaribio ya vitro, utambuzi wa masalia muhimu yaliyobadilishwa katika tovuti ya kichocheo ya upungufu wa maji mwilini ya kimeng'enya kilichokomaa.yote yamejengwa upya kwa “Ca”.E. malaspinii genome (data iliyopanuliwa, Kielelezo 9 na maelezo ya ziada) na, hatimaye, shughuli za kibiolojia ya bidhaa ya fosforasi, lakini sio fomu ya kemikali ya dehydrated (Mchoro 4d).Kwa hakika, tuligundua kuwa inaonyesha shughuli ya chini ya kuzuia protease ya micromolar dhidi ya elastase ya neutrophil, ikilinganishwa na bidhaa nyingine zinazohusiana za asili katika safu ya mkusanyiko (IC50 = 14.3 μM) 44, licha ya ukweli kwamba jukumu la kiikolojia bado linapaswa kuelezewa.Kulingana na matokeo haya, tunapendekeza kutaja njia "phospheptin".
Kesi ya pili ni njia tata ya RiPP maalum kwa 'Ca.Jenasi Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) ilitabiriwa kusimba bidhaa za asili za protini (Mchoro 4e).Njia hizi ni za manufaa mahususi za kibayoteknolojia kwa sababu ya msongamano unaotarajiwa na aina mbalimbali za marekebisho ya kemikali yasiyo ya kawaida yaliyoanzishwa na vimeng'enya vilivyosimbwa na BGCs45 fupi kiasi.Tuligundua kuwa protini hii inatofautiana na protini zilizoainishwa hapo awali kwa kuwa haina motifu kuu ya NX5N ya polyceramides na kitanzi cha lanthionine cha landornamides 46.Ili kushinda vizuizi vya mifumo ya kawaida ya usemi wa heterologous, tulizitumia pamoja na mfumo maalum wa Microvirgula aerodenitrificans kubainisha vimeng'enya vinne vilivyokomaa (mbinu).Kwa kutumia mchanganyiko wa MS/MS, uwekaji lebo za isotopu, na NMR, tuligundua vimeng'enya hivi vilivyokomaa katika kiini cha asidi ya amino 46 ya peptidi (Mchoro 4f, g, data iliyopanuliwa, Mtini. 10-12 na maelezo ya ziada).Miongoni mwa Enzymes kukomaa, sisi sifa ya kuonekana ya kwanza ya FkbM O-methyltransferase mwanachama wa familia 47 katika RiPP njia na bila kutarajia iligundua kuwa enzyme hii kukomaa utangulizi uti wa mgongo N-methylation (Mtini. 4h, i na maelezo ya ziada).Ingawa urekebishaji huu unajulikana katika bidhaa asilia za NRP48, N-methylation ya enzymatic ya vifungo vya amide ni mmenyuko changamano lakini muhimu wa kibioteknolojia49 ambao hadi sasa umekuwa wa manufaa kwa familia ya RiPP ya borosine.Umaalumu 50,51.Utambulisho wa shughuli hii katika familia zingine za vimeng'enya na RiPP unaweza kufungua programu mpya na kupanua utendakazi wa aina mbalimbali za protini 52 na utofauti wao wa kemikali.Kulingana na marekebisho yaliyotambuliwa na urefu usio wa kawaida wa muundo wa bidhaa unaopendekezwa, tunapendekeza jina la njia "pythonamide".
Ugunduzi wa enzymolojia isiyotarajiwa katika familia yenye sifa ya utendaji ya vimeng'enya unaonyesha ahadi ya jenomiki ya mazingira kwa uvumbuzi mpya, na pia unaonyesha uwezo mdogo wa makisio ya utendaji kulingana na mfuatano wa homolojia pekee.Kwa hivyo, pamoja na ripoti za RiPPs za poliphosphorylated zisizo za kisheria, matokeo yetu yanaonyesha thamani kubwa ya rasilimali lakini muhimu kwa juhudi za baiolojia ya sintetiki ili kufichua kikamilifu utajiri wa utendaji, utofauti na miundo isiyo ya kawaida ya misombo ya kemikali ya kibayolojia.
Hapa tunaonyesha anuwai ya uwezo wa kibiolojia uliosimbwa na vijiumbe na muktadha wao wa jeni katika mikrobiome ya kimataifa ya baharini, kuwezesha utafiti wa siku zijazo kwa kufanya rasilimali itakayopatikana ipatikane kwa jumuiya ya wanasayansi (https://microbiomics.io/ocean/).Tuligundua kwamba mengi ya uvumbuzi wake wa filojenetiki na utendakazi unaweza kupatikana tu kwa kuunda upya MAGS na SAGs, haswa katika jumuiya za viumbe hai ambazo hazijatumika sana ambazo zinaweza kuongoza juhudi za baadaye za utafutaji wa viumbe hai.Ingawa tutazingatia hapa 'Ca.Eudormicrobiaceae” kama ukoo hasa “wenye vipaji” kibiolojia, BGC nyingi zilizotabiriwa katika mikrobiota ambazo hazijagunduliwa kuna uwezekano wa kusimba enzymologia ambazo hazijaelezewa hapo awali ambazo hutoa michanganyiko yenye vitendo muhimu vya kimazingira na/au kibayoteknolojia.
Seti za data za metagenomic kutoka kwa tafiti kuu za baharini na mfululizo wa muda zenye kina cha kutosha cha mpangilio zilijumuishwa ili kuongeza chanjo ya jumuiya za kimataifa za viumbe vidogo vya baharini katika mabonde ya bahari, tabaka za kina na baada ya muda.Seti hizi za data (Jedwali la Ziada 1 na Kielelezo 1) ni pamoja na metagenomics kutoka kwa sampuli zilizokusanywa katika bahari ya Tara (virusi vilivyoboreshwa, n=190; prokaryotic iliyoboreshwa, n=180)12,22 na msafara wa BioGEOTRACES (n=480).Mfululizo wa Saa za Bahari ya Hawaii (HOT, n = 68), Msururu wa Saa wa Bermuda-Atlantic (BATS, n = 62)21 na Msafara wa Malaspina (n = 58)23.Mpangilio wa usomaji kutoka kwa vipande vyote vya metagenomic ulichujwa kwa ubora kwa kutumia BBMap (v.38.71) kwa kuondoa adapta za mpangilio kutoka kwa usomaji, kuondoa usomaji uliowekwa kwenye mpangilio wa udhibiti wa ubora (PhiX genomes), na kutumia trimq=14, maq=20 hutupa ubora duni wa kusoma, maxns = 0 na minlength = 45. Uchambuzi uliofuata uliendeshwa au kuunganishwa na usomaji wa QC ikiwa imebainishwa (bbmerge.sh minoverlap=16).Masomo ya QC yalisawazishwa (bbnorm.sh target = 40, minddepth = 0) kabla ya kujengwa kwa kutumia metaSPAdes (v.3.11.1 au v.3.12 ikiwa inahitajika)53.Viunga vya kiunzi vilivyotokana (hapa vinajulikana kama scaffolds) hatimaye vilichujwa kwa urefu (≥1 kb).
Sampuli 1038 za metagenomic ziligawanywa katika vikundi, na kwa kila kundi la sampuli, usomaji wa udhibiti wa ubora wa metagenomic wa sampuli zote ulilinganishwa na mabano ya kila sampuli kando, na kusababisha idadi ifuatayo ya vikundi vilivyowekwa kwenye mabano: Virusi vya Tara Marine - Imeboreshwa. (190×190), Prokaryotes Imeboreshwa (180×180), BioGEOTRACES, HOT na BATS (610×610) na Malaspina (58×58).Uchoraji wa ramani ulifanyika kwa kutumia Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 ambayo inaruhusu usomaji kulinganishwa na tovuti za upili (kwa kutumia -a bendera).Mipangilio ilichujwa ili iwe na urefu wa angalau besi 45, iwe na utambulisho ≥97%, na muda wa kusoma ≥80%.Faili za BAM zilizotokana zilichakatwa kwa kutumia hati ya jgi_summarize_bam_contig_depths ya MetaBAT2 (v.2.12.1)55 ili kutoa huduma ya ndani na baina ya sampuli kwa kila kikundi.Hatimaye, mabano yaliwekwa katika makundi ili kuongeza usikivu kwa kuendesha MetaBAT2 kibinafsi kwenye sampuli zote zilizo na -minContig 2000 na -maxEdges 500. Tunatumia MetaBAT2 badala ya boxer ya pamoja kwa sababu imeonyeshwa katika majaribio huru kuwa bondia mmoja bora zaidi.na mara 10 hadi 50 kwa kasi zaidi kuliko mabondia wengine wanaotumiwa sana57.Ili kupima athari za uunganisho wa wingi, sampuli ndogo iliyochaguliwa kwa nasibu ya metagenomics (10 kwa kila hifadhidata mbili za Bahari ya Tara, 10 kwa BioGEOTRACES, 5 kwa kila mfululizo wa saa, na 5 kwa Malaspina) pia ilitumia sampuli pekee.Sampuli za ndani zimepangwa katika makundi ili kupata taarifa za chanjo.(Taarifa za ziada).
Jenomu za ziada (za nje) zilijumuishwa katika uchanganuzi uliofuata, ambazo ni MAGS 830 zilizochaguliwa kwa mikono kutoka seti ndogo ya hifadhidata ya Tara Oceans26, SAGs 5287 kutoka seti ya data ya GORG20, na data kutoka hifadhidata ya MAR (MarDB v. 4) kutoka REFs zilizotengwa 1707 na 682 SAGs) 27. Kwa mkusanyiko wa data wa MarDB, jenomu huchaguliwa kulingana na metadata inayopatikana ikiwa aina ya sampuli inalingana na usemi ufuatao wa kawaida: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] kutengwa'.
Ubora wa kila chombo cha metagenomic na jenomu za nje ulitathminiwa kwa kutumia CheckM (v.1.0.13) na Mtiririko wa Kazi wa Ukoo wa Anvi'o (v.5.5.0)58,59.Iwapo CheckM au Anvi'o wataripoti ≥50% utimilifu/ukamilifu na ≤10% uchafuzi/kutohitajika tena, basi hifadhi seli za metagenomic na jenomu za nje kwa uchanganuzi wa baadaye.Kisha alama hizi ziliunganishwa kuwa ukamilifu wa maana (mcpl) na maana ya uchafuzi (mctn) ili kuainisha ubora wa jenomu kulingana na vigezo vya jumuiya60 kama ifuatavyo: ubora wa juu: mcpl ≥ 90% na mctn ≤ 5%;ubora mzuri: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, ubora wa kati: mcpl ≥ 50% na mctn ≤ 10%, ubora wa haki: mcpl ≤ 90% au mctn ≥ 10%.Kisha jenomu zilizochujwa ziliunganishwa na alama za ubora (Q na Q') kama ifuatavyo: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (kubadilika kwa matatizo)/100 + 0.5 x log[N50] .(imetekelezwa katika dRep61).
Ili kuruhusu uchanganuzi linganishi kati ya vyanzo tofauti vya data na aina za jenomu (MAG, SAG na REF), jenomu 34,799 zilitengwa kulingana na utambulisho wa nyukleotidi wa upana wa genome (ANI) kwa kutumia dRep (v.2.5.4).Hurudiwa)61 na 95% ya vizingiti vya ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) na jeni za alama ya nakala moja kwa kutumia SpecI63 zinazotoa mkusanyiko wa genome katika kiwango cha spishi.Jenomu wakilishi ilichaguliwa kwa kila nguzo ya dRep kulingana na alama ya ubora wa juu zaidi (Q') iliyofafanuliwa hapo juu, ambayo ilichukuliwa kuwa wakilishi wa spishi.
Ili kutathmini kasi ya uchoraji ramani, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) ilitumiwa kuchora seti zote 1038 za usomaji wa metagenomic na jenomu 34,799 zilizomo kwenye OMD.Usomaji unaodhibitiwa na ubora ulichorwa katika hali ya kumalizia moja na upangaji uliosababishwa ulichujwa ili kubakisha tu mipangilio ≥45 bp kwa urefu.na utambulisho ≥95%.Uwiano wa onyesho kwa kila sampuli ni asilimia ya usomaji unaosalia baada ya uchujaji ukigawanywa na jumla ya idadi ya usomaji wa udhibiti wa ubora.Kwa kutumia mbinu hiyo hiyo, kila moja ya metagenome 1038 ilipunguzwa hadi kuingiza milioni 5 (data iliyopanuliwa, Mtini. 1c) na kuendana na GORG SAG katika OMD na katika GEM16 zote.Kiasi cha MAGS kilichopatikana kutoka kwa maji ya bahari katika katalogi ya GEM16 kiliamuliwa na maswali ya maneno muhimu ya vyanzo vya metagenomic, kuchagua sampuli za maji ya bahari (kwa mfano, kinyume na mchanga wa baharini).Hasa, tunachagua "za majini" kama "kitengo_cha_ikolojia", "baharini" kama "aina_ya_mfumo", na kuchuja "makazi" kama "bahari kuu", "baharini", "bahari ya bahari", "maji ya baharini", "maji ya baharini" , "Bahari", "Maji ya Bahari", "Maji ya Bahari ya Juu", "Maji ya Bahari ya Juu".Hii ilisababisha MAG 5903 (ubora wa juu 734) kusambazwa zaidi ya OTU 1823 (maoni hapa).
Jenomu za prokariyoti zilifafanuliwa kwa utaratibu kwa kutumia GTDB-Tk (v.1.0.2)64 na vigezo chaguo-msingi vinavyolenga GTDB r89 toleo la 13. Anvi'o ilitumiwa kutambua jenomu za yukariyoti kulingana na utabiri wa kikoa na kukumbuka ≥50% na upungufu ≤ 10%.Ufafanuzi wa taxonomic wa spishi unafafanuliwa kama mojawapo ya jenomu wakilishi.Isipokuwa yukariyoti (148 MAG), kila jenomu mara ya kwanza ilifafanuliwa kiutendaji kwa kutumia prokka (v.1.14.5)65, ikitaja jeni kamili, kufafanua vigezo vya "archaea" au "bakteria" inavyohitajika, ambayo pia inaripotiwa kwa wasio- jeni za kusimba.na maeneo ya CRISPR, miongoni mwa vipengele vingine vya jeni.Dokeza jeni zilizotabiriwa kwa kutambua jeni za alama moja za nakala moja (uscMG) kwa kutumia fetchMG (v.1.2)66, gawa vikundi vya orthologi na hoja kwa kutumia emapper (v.2.0.1)67 kulingana na eggNOG (v.5.0)68.Hifadhidata ya KEGG (iliyochapishwa Februari 10, 2020) 69. Hatua ya mwisho ilitekelezwa kwa kulinganisha protini na hifadhidata ya KEGG kwa kutumia DIAMOND (v.0.9.30)70 ikiwa na hoja na mada ya ≥70%.Matokeo yalichujwa zaidi kulingana na NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71 kulingana na bitrate ≥ 50% ya upeo wa juu unaotarajiwa wa biti (kiungo chenyewe).Mifuatano ya jeni pia ilitumiwa kama ingizo ili kutambua BGC katika jenomu kwa kutumia antiSMASH (v.5.1.0)72 yenye vigezo chaguomsingi na milipuko tofauti ya makundi.Jenomu na maelezo yote yamekusanywa kuwa OMD pamoja na metadata ya muktadha inayopatikana kwenye wavuti (https://microbiomics.io/ocean/).
Sawa na mbinu zilizoelezwa hapo awali12,22 tulitumia CD-HIT (v.4.8.1) kuunganisha > jeni za usimbaji protini milioni 56.6 kutoka kwa bakteria na genome za kiakiolojia kutoka kwa OMD hadi 95% ya utambulisho na jeni fupi zaidi (90% chanjo)73 hadi > Nguzo za jeni milioni 17.7.Mfuatano mrefu zaidi ulichaguliwa kama jeni wakilishi kwa kila nguzo ya jeni.Kisha metagenomu 1038 zililinganishwa na > wanachama milioni 17.7 wa nguzo za BWA (-a) na faili zilizotokana za BAM zilichujwa ili kubaki na mipangilio tu yenye utambulisho wa ≥95% na ≥45 upangaji msingi.Wingi wa jeni uliorekebishwa kwa urefu ulikokotolewa kwa kuhesabu viingilio vya kwanza kutoka kwa upangaji bora wa kipekee na kisha, kwa vichochezi vilivyo na ramani isiyoeleweka, na kuongeza hesabu za sehemu kwa jeni lengwa zinazolingana sawia na idadi yao ya vichochezi vya kipekee.
Jenomu kutoka kwa OMD iliyopanuliwa (pamoja na MAGN ya ziada kutoka "Ca. Eudormicrobiaceae", tazama hapa chini) ziliongezwa kwenye hifadhidata ya zana ya uchanganuzi wa metagenomic ya moTUs74 (v.2.5.1) ili kuunda hifadhidata iliyopanuliwa ya marejeleo ya mOTU.Ni jenomu sita za nakala moja pekee (jenomu 23,528) zilizosalia kati ya uscMG kumi.Upanuzi wa hifadhidata ulisababisha makundi 4,494 ya ziada katika kiwango cha spishi.Metagenome 1038 zilichanganuliwa kwa kutumia vigezo chaguo-msingi vya mOTU (Mst.2).Jumla ya jenomu 989 zilizomo katika makundi 644 ya moTU (95% REF, 5% SAG na 99.9% mali ya MarDB) hazikugunduliwa na wasifu wa moTU.Hii inaonyesha vyanzo mbalimbali vya ziada vya kutengwa kwa baharini kwa jenomu za MarDB (jenomu nyingi ambazo hazijagunduliwa zinahusishwa na viumbe vilivyotengwa na mchanga, majeshi ya baharini, nk).Ili kuendelea kuangazia mazingira ya bahari iliyo wazi katika utafiti huu, tuliziondoa kwenye uchanganuzi wa chini ya maji isipokuwa ziligunduliwa au kujumuishwa katika hifadhidata iliyopanuliwa ya mOTU iliyoundwa katika utafiti huu.
BGC zote kutoka MAG, SAG na REF katika OMD (tazama hapo juu) ziliunganishwa na BGC zilizotambuliwa katika kiunzi zote za metagenomic (antiSMASH v.5.0, vigezo chaguo-msingi) na zilizoainishwa kwa kutumia BiG-SLICE (v.1.1) (kikoa cha PFAM )75.Kulingana na vipengele hivi, tulikokotoa umbali wote wa cosine kati ya BGC na kuvipanga (viungo vya maana) katika GCF na GCC kwa kutumia vizingiti vya umbali vya 0.2 na 0.8 mtawalia.Viwango hivi ni urekebishaji wa vizingiti vilivyotumika hapo awali kwa kutumia Euclidean distance75 pamoja na umbali wa cosine, ambayo hupunguza baadhi ya hitilafu katika mkakati wa awali wa nguzo wa BiG-SLICE (Maelezo ya Ziada).
Kisha BGC zilichujwa ili kubaki ≥5 kb zilizosimbwa kwenye kiunzi ili kupunguza hatari ya kugawanyika kama ilivyoelezwa hapo awali16 na kuwatenga MarDB REF na SAGs ambazo hazikupatikana katika metagenomes 1038 (tazama hapo juu).Hii ilisababisha jumla ya BGC 39,055 kusimbwa na jenomu ya OMD, na 14,106 za ziada zilitambuliwa kwenye vipande vya metagenomic (yaani hazijaunganishwa katika MAGs).BGC hizi za "metagenomic" zilitumiwa kukadiria uwiano wa uwezekano wa usanisi wa viumbe hai wa baharini ambao haujanaswa katika hifadhidata (Maelezo ya Ziada).Kila BGC iliainishwa kiutendaji kulingana na aina za bidhaa za ubashiri zinazofafanuliwa na kategoria za anti-SMASH au bidhaa mbovu zaidi zilizofafanuliwa katika BiG-SCAPE76.Ili kuzuia upendeleo wa sampuli katika ujanibishaji (muundo wa kitabia na utendaji wa GCC/GCF, umbali wa GCF na GCC kwa hifadhidata za marejeleo, na wingi wa metagenomic wa GCF), kwa kuweka BGC ndefu zaidi kwa kila GCF kwa kila spishi, BGC 39,055 zilitolewa zaidi, na kusababisha jumla ya BGC 17,689.
Ubunifu wa GCC na GCF ulitathminiwa kulingana na umbali kati ya hifadhidata iliyokokotwa (database ya RefSeq katika BiG-FAM)29 na iliyothibitishwa kwa majaribio (MIBIG 2.0)30 BGC.Kwa kila mojawapo ya BGC wakilishi 17,689, tulichagua umbali mdogo kabisa wa kosine kwenye hifadhidata husika.Umbali huu wa chini basi hukadiriwa (wastani) kulingana na GCF au GCC, inavyofaa.GCF inachukuliwa kuwa mpya ikiwa umbali wa hifadhidata ni mkubwa kuliko 0.2, ambayo inalingana na utengano bora kati ya (wastani) wa GCF na rejeleo.Kwa GCC, tunachagua 0.4, ambayo ni mara mbili ya kizingiti kilichofafanuliwa na GCF, ili kufunga uhusiano wa muda mrefu na viungo.
Wingi wa metagenomic wa BGC ulikadiriwa kuwa wastani wa wingi wa jeni zake za kibayolojia (kama inavyobainishwa na anti-SMASH) inayopatikana kutoka kwa wasifu wa kiwango cha jeni.Wingi wa metagenomic wa kila GCF au GCC ulikokotolewa kama jumla ya BGCs wakilishi (kati ya 17,689).Ramani hizi nyingi zilirekebishwa baadaye kwa utunzi wa seli kwa kutumia hesabu ya kila sampuli ya mOTU, ambayo pia ilichangia juhudi za mfuatano (data iliyopanuliwa, Mtini. 1d).Kuenea kwa GCF au GCC kulikokotolewa kama asilimia ya sampuli zilizo na wingi > 0.
Umbali wa Euclidean kati ya sampuli ulikokotolewa kutoka kwa wasifu wa kawaida wa GCF.Umbali huu ulipunguzwa kwa ukubwa kwa kutumia UMAP77 na upachikaji uliosababisha ulitumika kwa nguzo zisizodhibitiwa za msongamano kwa kutumia HDBSCAN78.Idadi ya chini kabisa ya pointi kwa kundi (na hivyo idadi ya makundi) inayotumiwa na HDBSCAN inabainishwa kwa kuongeza uwezekano wa limbikizo la uanachama wa kundi.Vikundi vilivyotambuliwa (na sampuli ndogo ya nasibu iliyosawazishwa ya vikundi hivi ili kutoa hesabu ya upendeleo katika uchanganuzi wa utofauti wa kila aina (PERMANOVA) ulijaribiwa kwa umuhimu dhidi ya umbali wa Euclidean ambao haujapunguzwa kwa kutumia PERMANOVA.Ukubwa wa wastani wa jenomu wa sampuli ulikokotolewa kulingana na wingi wa moOTU na makadirio ya saizi ya jenomu ya washiriki wa jenomu.Hasa, saizi ya wastani ya jenomu ya kila moTU ilikadiriwa kuwa wastani wa saizi za jenomu za wanachama wake zilizosahihishwa kwa ukamilifu (baada ya kuchujwa) (kwa mfano, jenomu kamili ya 75% yenye urefu wa Mb 3 ina saizi iliyorekebishwa ya 4. Mb).kwa jenomu za kati zenye uadilifu ≥70%.Wastani wa saizi ya jenomu kwa kila sampuli ilikokotolewa kama jumla ya saizi za genome za mOTU zilizopimwa kwa wingi.
Seti iliyochujwa ya BGC zilizosimbwa za jenomu katika OMD inaonyeshwa katika miti ya GTDB ya bakteria na ya zamani (katika mifumo ≥5 kb, ukiondoa REF na SAG MarDB haipatikani katika metagenomes 1038, tazama hapo juu) na aina za bidhaa zilizotabiriwa kulingana na filojenetiki. nafasi ya genome (tazama hapo juu).Kwanza tulipunguza data kulingana na spishi, kwa kutumia jenomu yenye BGC nyingi zaidi katika spishi hiyo kama kiwakilishi.Kwa taswira, wawakilishi waligawanywa zaidi katika vikundi vya miti, na tena, kwa kila safu ya seli, jenomu iliyo na idadi kubwa zaidi ya BGC ilichaguliwa kama mwakilishi.Spishi zilizoboreshwa na BGC (angalau jenomu moja iliyo na > BGC 15) zilichanganuliwa zaidi kwa kukokotoa Shannon Diversity Index kwa aina za bidhaa zilizosimbwa katika BGC hizo.Ikiwa aina zote za bidhaa zilizotabiriwa ni sawa, mchanganyiko wa kemikali na BGC zingine changamano (kama ilivyotabiriwa na anti-SMAH) huchukuliwa kuwa ya aina moja ya bidhaa, bila kujali mpangilio wao katika nguzo (km mchanganyiko wa protini-bacteriocin na bacteriocin-proteoprotein). mwili).mseto).
DNA iliyosalia (inakadiriwa kuwa ng 6) kutoka sampuli ya Malaspina MP1648, inayolingana na sampuli ya kibayolojia SAMN05421555 na inalingana na Illumina SRR3962772 iliyosomwa kwa muda mfupi, iliyochakatwa kulingana na itifaki ya mpangilio ya PacBio na pembejeo ya chini kabisa ya kutumia sampuli ya DNA ya GSMBio kit (100-980-000) na SMRTbell Express 2.0 kit ya kuandaa kiolezo (100-938-900).Kwa ufupi, DNA iliyosalia ilikatwa, kurekebishwa na kusafishwa (ProNex shanga) kwa kutumia Covaris (g-TUBE, 52104).DNA Iliyosafishwa kisha inakabiliwa na utayarishaji wa maktaba, ukuzaji, utakaso (ushanga wa ProNex) na uteuzi wa saizi (> kb 6, Blue Pippin) kabla ya hatua ya mwisho ya utakaso (ProNex shanga) na mpangilio kwenye jukwaa la Sequel II.
Ujenzi upya wa mbili za kwanza ca.Kwa MAG Eremiobacterota, tulitambua ANI sita za ziada >99% (hizi zimejumuishwa kwenye Kielelezo 3), ambazo awali zilichujwa kulingana na alama za uchafuzi (baadaye zilitambuliwa kama marudio ya jeni, angalia hapa chini).Pia tulipata trei iliyoandikwa "Ca".Eremiobacterota” kutoka kwa tafiti mbalimbali23 na kuzitumia pamoja na MAGN nane za utafiti wetu kama marejeleo ya usomaji wa metagenomic kutoka kwa sampuli 633 za yukariyoti (>0.8 µm) zilizorutubishwa kwa kutumia BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - bendera) kwa sampuli zilizopunguzwa. ramani (milioni 5 inasomwa).Kulingana na ramani za uboreshaji mahususi (zinazochujwa kwa utambulisho wa 95% wa ulinganifu na 80% ya usomaji wa habari), metagenome 10 (ufunikaji unaotarajiwa ≥5×) zilichaguliwa kwa ajili ya kukusanyika na metagenome 49 za ziada (inatarajiwa ≥1×) kwa uwiano wa maudhui.Kwa kutumia vigezo sawa na hapo juu, sampuli hizi zilipigwa pini na 'Ca' 10 za ziada ziliongezwa.MAG Eremiobacterota imerejeshwa.MAGU haya 16 (bila kuhesabu mbili tayari kwenye hifadhidata) huleta jumla ya idadi ya jenomu katika OMD iliyopanuliwa hadi 34,815.MAG hupewa safu za ushuru kulingana na ufanano wao wa jeni na nafasi katika GTDB.MAG 18 ziliondolewa nakala kwa kutumia dRep kuwa spishi 5 (intraspecific ANI >99%) na jenera 3 (intrageneric ANI 85% hadi 94%) ndani ya familia moja79.Wawakilishi wa spishi walichaguliwa kwa mikono kulingana na uadilifu, uchafuzi, na N50.Neno la majina linalopendekezwa limetolewa katika Taarifa ya Ziada.
Tathmini uadilifu na uchafuzi wa 'Ca.MAG Eremiobacterota, tulitathmini uwepo wa uscMG, pamoja na seti za jeni za nakala moja-nakala maalum za ukoo zinazotumiwa na CheckM na Anvi'o.Utambulisho wa nakala 2 kati ya uscMG 40 ulithibitishwa na uundaji upya wa filojenetiki (tazama hapa chini) ili kuondoa uwezekano wa uchafuzi (hii inalingana na 5% kulingana na jeni hizi 40 za alama).Utafiti wa ziada wa wawakilishi watano wa MAGs 'Ca.Kiwango cha chini cha vichafuzi katika jenomu hizi zilizoundwa upya kilithibitishwa kwa spishi za Eremiobacterota kwa kutumia kiolesura shirikishi cha Anvi'o kulingana na wingi na uwiano wa utunzi wa mfuatano (Maelezo ya Ziada)59.
Kwa uchambuzi wa phylogenomic, tulichagua MAGs tano za mwakilishi "Ca".Eudormicrobiaceae", spishi zote "Ca.Jenomu ya Eremiobacterota na wanachama wa phyla nyingine (ikiwa ni pamoja na UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria na Planctomycetota) inapatikana kutoka GTDB (r89)13.Jenomu hizi zote zilifafanuliwa kama ilivyofafanuliwa hapo awali kwa uchimbaji wa jeni la nakala moja na ufafanuzi wa BGC.Jenasi za GTDB zilihifadhiwa kulingana na vigezo vilivyo hapo juu vya uadilifu na uchafuzi.Uchambuzi wa phylogenetic ulifanywa kwa kutumia mtiririko wa kazi wa Anvi'o Phylogenetics59.Mti huu uliundwa kwa kutumia IQTREE (v.2.0.3) (chaguo-msingi na -bb 1000)80 kwenye upatanishi wa protini 39 za tandem za ribosomal zilizotambuliwa na Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.Nafasi zake zilipunguzwa.kufikia angalau 50% ya genome82 na Planctomycecota ilitumika kama kikundi cha nje kulingana na topolojia ya miti ya GTDB.Mti mmoja wa uscMG 40 ulijengwa kwa kutumia zana na vigezo sawa.
Tulitumia Traitar (v.1.1.2) na vigezo chaguo-msingi (phenotype, kutoka nyukleotidi)83 kutabiri sifa za kawaida za viumbe vidogo.Tuligundua mtindo wa maisha unaowezekana wa unyanyasaji kulingana na faharasa ya uwindaji iliyotengenezwa hapo awali84 ambayo inategemea maudhui ya jeni ya kuweka msimbo wa protini katika jenomu.Hasa, tunatumia DIAMOND kulinganisha protini katika jenomu dhidi ya hifadhidata ya OrthoMCL (v.4)85 kwa kutumia chaguo -nyeti zaidi -id 25 -jalada la maswali 70 -jalada-jalada 70 -juu 20 NA kuhesabu jeni zinazolingana na jeni za alama kwa wanyama wanaowinda wanyama wengine na wasio wawindaji.Fahirisi ni tofauti kati ya idadi ya alama za uwindaji na zisizo za uwindaji.Kama udhibiti wa ziada, tulichanganua pia jenomu ya "Ca".Kipengele cha Entotheonella TSY118 kinatokana na uhusiano wake na Ca.Eudoremicrobium (ukubwa mkubwa wa genome na uwezo wa biosynthetic).Kisha, tulijaribu viunganishi vinavyowezekana kati ya jeni za wanyama wanaokula wanyama wengine wala wanyama wanaokula wenzao na uwezo wa kibiosynthetic wa Ca.Eudormicrobiaceae” na ikagundua kuwa hakuna jeni zaidi ya moja (kutoka kwa aina yoyote ya jeni ya kialama, yaani jeni inayowinda wanyama wengine/isiyo mahasimu) hupishana na BGC, na kupendekeza kuwa BGC haisumbui ishara za uwindaji.Ufafanuzi wa ziada wa kijinomiki wa nakala zilizopigwa ulitekelezwa kwa kutumia TXSSCAN (v.1.0.2) ili kuchunguza mahususi mfumo wa usiri, pili, na flagella86.
Wawakilishi watano 'Ca's walichorwa kwa kuchora ramani 623 za metatranscriptome kutoka sehemu za urutubishaji za prokariyoti na yukariyoti za bahari ya Tara22,40,87 (kwa kutumia BWA, v.0.7.17-r1188, -a bendera).Eudormicrobiaceae genome.Faili za BAM zilichakatwa na FeatureCounts (Mst.2.0.1)88 baada ya 80% kusomwa na 95% kuchuja utambulisho (pamoja na kipengele cha chaguoHesabu -msingi -O -fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Huhesabu idadi ya viingilio kwa kila jeni.Ramani zilizozalishwa zilisawazishwa kwa urefu wa jeni na wingi wa jeni za alama moOTU (hesabu ya wastani ya urefu iliyorekebishwa ya uwekaji kwa jeni zilizo na hesabu ya kupachika >0) na kumbukumbu ilibadilishwa hadi 22.74 ili kupata mwonekano wa jamaa kwa kila seli ya kila kiwango cha jeni, ambayo pia inaelezea tofauti kutoka kwa sampuli hadi sampuli wakati wa mpangilio.Uwiano kama huo huruhusu uchanganuzi wa kulinganisha, kupunguza shida za utunzi wakati wa kutumia data ya wingi.Sampuli zilizo na >5 kati ya jeni 10 za alama za moTU ndizo zilizingatiwa kwa uchanganuzi zaidi ili kuruhusu sehemu kubwa ya kutosha ya jenomu kutambuliwa.
Wasifu uliosawazishwa wa nukuu ya 'Ca.E. taraoceanii ilikabiliwa na kupunguzwa kwa vipimo kwa kutumia UMAP na uwakilishi uliotokana ulitumika kwa mikusanyiko isiyosimamiwa kwa kutumia HDBSCAN (tazama hapo juu) ili kubainisha hali ya kujieleza.PERMANOVA hupima umuhimu wa tofauti kati ya makundi yaliyotambuliwa katika nafasi ya awali (isiyopunguzwa) ya umbali.Usemi wa tofauti kati ya hali hizi ulijaribiwa kote kwenye jenomu (tazama hapo juu) na njia 201 za KEGG zilitambuliwa katika vikundi 6 vya utendaji, ambavyo ni: BGC, mfumo wa usiri na jeni za bendera kutoka TXSSCAN, vimeng'enya vya uharibifu (protease na peptidasi), na wanyama wanaokula wenzao na wasio- jeni za uwindaji.alama za fahirisi za walaghai.Kwa kila sampuli, tulikokotoa usemi wa wastani wa kawaida kwa kila darasa (kumbuka kuwa usemi wa BGC wenyewe huhesabiwa kama usemi wa wastani wa jeni za kibayolojia kwa BGC hiyo) na kujaribiwa kwa umuhimu katika majimbo yote (jaribio la Kruskal-Wallis limerekebishwa kwa FDR).
Jeni za syntetisk zilinunuliwa kutoka kwa GenScript na vianzio vya PCR vilinunuliwa kutoka kwa Microsynth.Phusion polymerase kutoka Thermo Fisher Scientific ilitumika kwa ukuzaji wa DNA.NucleoSpin plasmids, jeli ya NucleoSpin na vifaa vya utakaso vya PCR kutoka Macherey-Nagel vilitumika kusafisha DNA.Vimeng'enya vya kizuizi na ligase ya T4 ya DNA vilinunuliwa kutoka kwa Biolabs ya New England.Kemikali zaidi ya isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) na 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) zilinunuliwa kutoka Sigma-Aldrich na kutumika bila utakaso zaidi.Dawa za viuavijasumu chloramphenicol (Cm), spectinomycin dihydrochloride (Sm), ampicillin (Amp), gentamicin (Gt), na carbenicillin (Cbn) zilinunuliwa kutoka kwa AppliChem.Vipengee vya maudhui ya Bacto Tryptone na Bacto Yeast Extract vilinunuliwa kutoka BD Biosciences.Trypsin kwa mpangilio ilinunuliwa kutoka Promega.
Mifuatano ya jeni ilitolewa kutoka kwa anti-SMASH iliyotabiriwa BGC 75.1.E. malaspinii (Maelezo ya ziada).
Jeni zilizopachikwa A (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4), na embAM (ikiwa ni pamoja na maeneo ya intergene) ziliundwa bila mpangilio 5 na (A. ized kwa kujieleza katika E lini.Jeni ya embA iliwekwa ndani ya tovuti ya kwanza ya uundaji wa sehemu nyingi (MCS1) ya pACYCDuet-1(CmR) na pCDFDuet-1(SmR) yenye maeneo ya mipasuko ya BamHI na HindIII.Jeni za embM na embMopt (iliyoboreshwa kwa kodoni) ziliwekwa ndani ya MCS1 pCDFDuet-1(SmR) na BamHI na HindIII na kuwekwa katika tovuti ya pili ya uundaji wa njia nyingi za pCDFDuet-1(SmR) na pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) na NdeI/ChoI.Kaseti ya embAM ilibadilishwa kuwa pCDFDuet1(SmR) na maeneo ya upasuaji ya BamHI na HindIII.Jeni ya orf3/embI (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) iliundwa kwa mwingiliano wa kiendelezi cha PCR kwa kutumia vianzio EmbI_OE_F_NdeI na EmbI_OE_R_XhoI, iliyomeng'enywa kwa NdeI/XhoIde-XhoICD-1MCD-1CD-FM lile lile, lile-XhoICDM na lig. Enzymes (Ziada meza).6).Kizuizi cha usagaji na kuunganishwa kwa kimeng'enya kilifanywa kulingana na itifaki ya mtengenezaji (New England Biolabs).